Mise au point d'un dosage de l'activité kinase de la protéine DYRK1A et Régulation épigénétique de l'expression du gène codant le facteur de transcription ISL1

Epigenetic regulations of ISL1 gene expression, a key factor in the differentiation of the gonadotrope cell lineage and the expression of the GnRH receptor

• Auteur / Autrice : Laure Tabouy
• Direction : Jean-Noël Laverrière, Julien Dairou
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biomolécules, biologie structurale, pathologies et biothérapies
• Date : Soutenance en 2012
• Etablissement(s) : Paris 7

Mots clés

Mots clés contrôlés

Modèles animaux de maladie humaine

Protein kinases

Syndrome de Down

Récepteurs à la gonadolibérine

Glandes endocrines

DYRK1A (enzyme)

Résumé

Le Syndrome de Down, aneuploïdie la plus courante, a pour cause première la présence d'un chromosome 21 Numéraire. L'établissement de cartes de corrélation génotypes/phénotypes chez les patients atteints du Syndrome de Down a permis de mettre en évidence la kinase DYRKIA, codée par le gène DYRKIA localisé dans la région DCR-1 du chromosome 21, comme candidat pouvant être impliqué dans l'apparition d'un retard mental. Comprendre le rôle et la régulation de DYRKIA est donc essentiel et pour cela, utiliser un test fiable de mesure d'activité de l'enzyme est indispensable. Nous avons développé une nouvelle méthode de dosage de l'activité kinase de DYRKIA utilisant la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC). Cette méthode s'est révélée très sensible et peu coûteuse. En utilisant cette nouvelle méthode, nous avons confirmé les principales données obtenues in vitro sur l'activité de DYRKIA. Nous avons également caractérisé le comportement d'inhibiteurs connus de DYRKIA (harmine) et confirmé les résultats rapportés dans la littérature. En collaboration avec l'équipe du Dr. Dodd nous avons criblé des dérivés hétérocycliques azotés de faible poids moléculaire, inhibiteurs potentiels de DYRKIA. Enfin, le test d'activité a été utilisé ex vivo sur des extraits de cerveau de souris. Nos résultats indiquent que cette nouvelle méthode de dosage d'activité kinase est spécifique, reproductible et rapide. Elle peut potentiellement s'appliquer à d'autres kinases, phosphatases et plus largement à d'autres enzymes catalysant une réaction de modification de protéines.

La GnRH joue un rôle essentiel en régulant la sécrétion et la synthèse de LH et de FSH via des récepteurs spécifiques (GnRHR) exprimés à la surface des cellules gonadotropes hypophysaires. L'expression tissulaire spécifique du Gnrhr est contrôlée par une combinatoire bien définie de facteurs de transcription comportant trois acteurs majeurs, SF1, LHX3 et ISL1. Au contraire du Gnrhr, nous montrons que les séquences régulatrices d'M7 en amont du site d'initiation de transcription (TSS) sont insuffisantes pour diriger l'expression hypophysaire spécifique, suggérant l'existence de mécanismes additionnels. De fait, les régions régulatrices (ou promoteurs) ainsi que les "corps" des gènes sont altérés par des modifications épigénétiques. Les résultats, obtenus par immunoprécipitation de la chromatine, montrent que dans les lignées cellulaires exprimant Isl1, notamment les cellules gonadotropes, Isl1 est complexé avec des histones H3 triméthylées sur la Lys4 (H3K4Me3) au niveau du TSS, une marque d'histones corrélée avec les gènes actifs. En revanche, dans les lignées cellulaires où Isll est silencieux, il est complexé avec des histones H3 triméthylées sur la Lys27, marque liée à la répression des gènes. On observe cette même corrélation au niveau du TSS du Gnrhr. De plus, notre étude suggère que la méthylation de F ADN, en amont de l'îlot CpG est inversement corrélée à l'activité de ce gène. Ces données suggèrent que les modifications épigénétiques sont essentiellement responsables de l'expression hypophysaire spécifique d'/s/ycontrairement à l'expression du Gnrhr qui semble principalement dépendante de la présence de facteurs de transcription tissulaires spécifiques majeurs.