Etude structurale et fonctionnelle de peptides lasso à l'aide de méthodes spectroscopiques

Structural and functional studies of lasso peptides using spectroscopic methods

• Auteur / Autrice : Rémi Ducasse
• Direction : Sylvie Rebuffat
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance en 2012
• Etablissement(s) : Paris 6

Mots clés

Mots clés contrôlés

Spectroscopie

Mutagenèse

Peptides

Résumé

Les peptides lasso sont des peptides synthétisés par les bactéries selon la voie ribosomale et qui subissent des modifications post-traductionnelles, leur conférant une topologie remarquable incluant un nœud moléculaire. Ils possèdent un cycle macrolactame N-terminal, dans lequel est insérée et piégée la queue C- terminale. Cette topologie est stabilisée par des contraintes stériques et/ou des ponts disulfure. Leurs propriétés biologiques (antagonistes de récepteurs, inhibiteurs d’enzymes pouvant leur conférer des propriétés antivirales ou antibactériennes) et la très grande stabilité de leur structure «lasso» leur confèrent un fort attrait biotechnologique. Ce travail de thèse s’inscrit dans le contexte de compréhension des éléments de séquence gouvernant la topologie et l’activité de ces peptides, à travers le développement de méthodes spectroscopiques. Les relations structure/activité d’un peptide lasso antibactérien produit par Escherichia coli, la microcine J25 (MccJ25) ont été examinées. Une mutagenèse dirigée sur le précurseur a permis de générer des variants de MccJ25, dont la topologie (structure en lasso ou cyclique-branchée) a été déterminée par LC-MS/MS, digestion par la carboxypeptidase Y, et pour certains par RMN. L’activité antibactérienne contre Salmonella enterica a été mesurée. Les éléments gouvernant le piégeage stérique de la queue C-terminale dans le cycle macrolactame ont été identifiés. Les résidus situés sous le cycle (Tyr20, Gly21) et la taille du cycle sont critiques pour la topologie et l’activité antibactérienne, tandis que la réduction de la taille de la boucle Tyr9-Ser18 au-dessus du cycle ou l’allongement de la queue C- terminale Tyr20-Gly21 sous le cycle ne perturbent pas la topologie en lasso, mais ont des effets sur l’activité, allant de la réduction à la suppression. Nous avons isolé et caractérisé un nouveau peptide lasso produit par Streptomyces sviceus découvert par exploration des génomes, la svicéucine. La structure tridimensionnelle du peptide a été déterminée d’après les données de RMN en solution. Ce peptide présente un cycle macrolactame de 9 résidus dans lequel est piégée la queue C-terminale, la structure étant stabilisée par deux ponts disulfures cycle-queue, Cys1/Cys13 et Cys7/Cys19. Ce nouveau peptide s'apparente à des peptides lasso antimicrobiens et anti-HIV comme RP 71955. Il possède une activité antimicrobienne contre des bactéries à Gram positif. Enfin, une étude spectroscopique de différents peptides lasso nous a permis de décrire des signaux caractéristiques des régions structurales de peptides lasso. L’étude de la dynamique de MccJ25 par relaxation de spin 15N en RMN montre une certaine inhomogénéité de la mobilité interne de ses résidus selon leur position dans la structure « lasso ». En outre, l’étude par dichroïsme circulaire de MccJ25, de la svicéucine et de la capistruine (peptide lasso produit par Bhurkholderia thailandensis), a révélé que certains peptides lasso présentent une bande positive autour de 220 nm, caractéristique de la topologie lasso

Lasso peptides are ribosomally-synthesized and post-translationnally modified peptides produced by bacteria, sharing a knotted topology. They present a N-terminal macrolactam ring and the C-terminal tail is threaded through this ring. Strong sterical constraints and/or disulfide bridges stabilize this scaffold. Due to there biological activities (as receptor antagonists, enzyme inhibitors which confer them antiviral or antibacterial activity) and the high stability of there “lasso” structure, they present a great biotechnical interest. This PhD work participates to the comprehension of the sequence determinants governing the topology and the activity of these peptides, using the development of spectroscopic methods. Structure/activity relationships of microcin J25 (MccJ25), an antibacterial lasso peptide produced by Escherichia coli, were examined. MccJ25 variants were generated with a site-directed mutagenesis onto the gene encoding the precursor. The topology of the variants (lasso or cyclic-branched) was determined using LC- MS/MS, carboxypeptidase Y digestion, and in some case NMR. The antibacterial activity on Salmonella enterica was measured. Determinants governing the sterical trapping of the C-terminal tail were identified. Residues under the ring (Tyr20, Gly21) and the size of the rign are critical for the topology and the antibacterial activity, whereas the reduction of the loop Tyr9-Ser18 above the ring or the elongation of the C-terminal tail under the cycle maintain the lasso topology but decrease or abolish the activity. We isolated and characterized a new lasso peptide from Streptomyces sviceus and predicted by genome-mining, sviceucin. The tridimensional structure of the peptide was determined by solution NMR. This peptide presents a C-terminal tail threaded through a nine-residues macrolactam ring. Two disulfide bridges between the ring and the tail, Cys1/Cys13 and Cys7/Cys19, stabilize the structure. This new peptide is highly similar to other antimicrobial and antiviral lasso peptides, as RP-71955. He presents an antibacterial activity against Gram-positive bacteria. Finally, a spectroscopic study of several lasso peptides permits us to describe specific signals of structural regions of lasso peptides. The dynamic study of MccJ25 by 15N spin relaxation shows an inhomogeneity of internal mobility of residues according to their position on the “lasso” topology. Moreover, the study by circular dichroism of MccJ25, sviceucin and capistruin (lasso peptide from Burkholderia thailendensis) reveals that some lasso peptides present a 220 nm positive band, specific of the lasso structure