Molecular features and mechanisms of regulation of Na+/H+ exchangers expressed in the plasma membrane and in intracellular compartments

par Nina Milosavljevic

Thèse de doctorat en Sciences de la vie

Sous la direction de Laurent Counillon et de Mallorie Poet.

Soutenue en 2012

à Nice .

  • Titre traduit

    Les échangeurs Na+/H+ exprimés à la membrane plasmique et dans les compartiments intracellulaires : mécanismes moléculaires, fonction et régulation


  • Résumé

    La famille des échangeurs sodium-proton de mammifères (Na+/H+ Exchangers, NHE) contient 10 membres. Les formes membranaires NHE1-NHE5 sont impliquées dans la régulation du pH intracellulaire, du volume cellulaire, ainsi que dans le transport vectoriel d’équivalents acide-base à travers les épithélia. NHE6, 7 et 9 sont localisés dans des compartiments intracellulaires. NHE10 est responsable de la régulation du pH de l'acrosome. Ce travail se concentre sur l’isoforme NHE1 exprimée à la membrane plasmique et sur l’isoforme intracellulaire NHE7. La première partie de cette thèse étudie les effets du cisplatine, un agent anticancéreux sur NHE1. Cette molécule provoque la mort cellulaire par la formation d'adduits à l'ADN. Chez les patients le cisplatine présente aussi une gamme d’effets secondaires à court terme, pour la plupart neurologiques. Ces effets peuvent être si pénibles qu'ils peuvent conduire à l'interruption de l'administration de cisplatine, même si le traitement est efficace sur la tumeur elle-même. Ils sont peu susceptibles d'être liés à l'action génomique du cisplatine, et il a été proposé qu’ils pourraient être causés, au moins en partie, par une action sur les membranes cellulaires. Nous avons montré, en utilisant une combinaison de techniques (microscopie électronique, imagerie en temps réel, microscopie de force atomique) que le cisplatine modifie rapidement la morphologie de la membrane cellulaire sans effets significatifs sur l’organisation et les propriétés physiques de l’actine corticale. Nous avons alors cherché à savoir si cet effet aurait une incidence sur les transporteurs et canaux mécanosensibles très abondants dans le système nerveux et dans les organes impliqués dans mécanosensibilité. Nous avons montré que le cisplatine est un inhibiteur non compétitif de NHE1, et qu'il bloque de façon réversible les canaux Cl- et K+ mécanosensibles VSORC et TREK1, respectivement, avec des constantes d'inhibition similaires. En revanche, des transporteurs et canaux non-mécanosensibles (GLUT1, CFTR et TASK1), sont insensibles au cisplatine. Ce nouveau mécanisme pourrait constituer un dénominateur commun pour les effets secondaires neurologiques du cisplatine. La deuxième partie de ce travail se concentre sur NHE7, un membre hautement conservé des échangeurs des compartiments intracellulaires. Des mutations dans les gènes codant ces transporteurs sont associées à des maladies cognitives et neurodégénératives. Paradoxalement, la fonction précise de ces transporteurs n’est pas encore claire, car leur localisation empêche la mesure de leurs caractéristiques fonctionnelles. Le modèle communément accepté est qu’ils utilisent le potassium cytoplasmique pour catalyser une fuite de protons hors des compartiments intracellulaires. Par des techniques de génétique somatique cellulaire, nous avons sélectionné une lignée de fibroblastes qui exprime un NHE7 de type sauvage à la membrane plasmique. Cela nous a permis de mesurer pour la première fois sa cinétique, sa sélectivité et ses caractéristiques pharmacologiques. Nous avons ensuite développé une stratégie et des outils pour mesurer son activité in situ en utilisant des sondes fluorescentes qui colocalisent avec cet échangeur dans les compartiments intracellulaires. Cette partie du travail montre pour la première fois que NHE7 possède des caractéristiques uniques qui en font un transporteur électroneutre de protons qui, contrairement à ce qui était supposé, acidifie les compartiments intracellulaires. Son activité se traduit par une accélération du trafic vésiculaire. Ce travail fournit des informations importantes pour comprendre les rôles physiologiques des échangeurs et leur implication dans des maladies neurologiques.


  • Résumé

    The family of mammalian Na+/H+ exchangers (NHEs) accounts for 10 members involved in pH regulation of cytosol and intracellular compartments. The first part of this thesis focused on the effects of an antineoplastic drug cisplatin on plasma membrane NHE1. Although cisplatin has been mostly documented to cause cell death through the formation of DNA adducts, in patients it exhibits a range of short-term side effects, mostly neurological that are unlikely to be related to its genomic action. In this context, we showed that cisplatin rapidly modifies cell membrane morphology without effects on cortical actin. We further showed that cisplatin inhibit mechanosensitive membrane transporter NHE1 and channels that are highly abundant in the nervous system. This new mechanism may constitute a common denominator to previously-unrelated neurological side effects of this drug that were not understood before. The second part of this work focused on NHE7, a member of the highly-conserved intracellular NHEs. Mutations in genes encoding these transporters are linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their role in cellular biology is still elusive as their localization prevented the accurate measurement of their functional features. We used an original strategy to expresses NHE7 at the plasma membrane, which enabled us to measure its kinetics, ion selectivity and pharmacological features. As NHE7is expressed in endosomes to get insight in its biological role we developed tools to measure its activity in situ. This work revealed for the first time that NHE7 works as a proton-loading mechanism those results in an enhanced rate of vesicular trafficking.

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  • Détails : 1 vol. (188 f.)
  • Annexes : Bibliogr. f. 160-187. Résumés en français, en serbe, et en anglais

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