Étude chez la levure Saccharomyces cerevisiae des relations entre la structure du petit ARN nucléolaire U3, ses interactions avec les protéines de la particule nucléolaire snoRNP U3 et sa fonction dans la biogenèse des ribosomes

Study to the yeast Saccharomyces cerevisiae of the relations between the U3 snoRNA structure, its interactions with proteins of the snoRNP U3 and its function in the of ribosome biogenesis

• Auteur / Autrice : Nicolas Rolland
• Direction : Christiane Branlant
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 14/12/2012
• Etablissement(s) : Université de Lorraine
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale BioSE - Biologie, Santé, Environnement
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : ARN-RNP, structure-fonction-maturation, Enzymologie Moléculaire et Structurale (Vandoeuvre-lès-Nancy)
• Jury : Président / Présidente : Alain Krol
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Bruno Charpentier
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Édouard Bertrand, Denis Lafontaine

Mots clés

Mots clés contrôlés

Mutagénèse dirigée

Séquence nucléotidique

ARN ribosomiques

Mots clés libres

Biogenèse des ARNr

Architecture de la snoRNP U3

Assemblage de la snoRNP U3

Protéine Rrp9p

Modélisation 3D par homologie

RRNA biogenesis

U3 snoRNP assembly

U3 snoRNP architecture

Rrp9p protein

3D structure homology modeling

Résumé

Le snoRNA U3 contient deux motifs conservés C'/D et de B/C qui permettent de recruter les protéines constitutives de la snoRNP U3. La liaison de la protéine Snu13p/15.5 kD à chacun de ces motifs est un préalable pour le recrutement des 4 autres protéines, à savoir : Nop1p, Nop56p et Nop58p sur le motif C'/D et de Rrp9p, une protéine spécifique du snoRNA U3, sur le motif B/C. Nous avons utilisé la structure 3D connue d'une protéine humaine contenant 7 motifs WD-40 et des méthodes de modélisation moléculaire pour proposer un modèle de structure 3D de Rrp9p. En parallèle, nous avons identifié les déterminants nécessaires à l'association des protéines Snu13p, Nop1p, Nop56p et Nop58p sur le motif C'/D du snoRNA U3, ceci en produisant différents variants du snoRNA U3 et en testant leurs capacités fonctionnelles et leurs stabilités dans la levure. Sur la base d'un modèle 3D d'une snoRNP C/D construit par C. Charron, nous avons ensuite formulé des hypothèses sur les interactions possibles entre le motif C'/D et les acides aminés des protéines Snu13p et Nop58p et confirmé ces hypothèses par mutagénèse dirigée. Les données ont en plus révélé qu'une faible quantité de snoRNA U3 est suffisante pour assurer la croissance des levures. Toujours par mutagénèse dirigée et étude des conséquences in cellulo, j'ai pu montrer quelles sont les contraintes en distance entre les motifs C'/D et B/C. Ce qui nous permet de formuler des hypothèses sur leurs positionnements relatifs dans la snoRNP. Au total mon travail a permis d'apporter des informations importantes sur l'architecture et les contraintes fonctionnelles de la snoRNP U3 de levure

U3 snoRNA contains two conserved pairs of boxes C'/D and B/C needed to bind the stably associated proteins. Binding of protein Snu13p/15.5 kD to each of the conserved motifs is a prerequisite for recruitment of the 4 other U3 snoRNP proteins, namely: Nop1p, Nop56p and Nop58p on the C'/D motif and the Rrp9p U3 specific protein on the B/C motif. We used the known 3D structure of a human G protein containing 7 WD-40 motifs and 3D structure homology modeling methods to build a 3D structure model for Rrp9p. In parallel, by production of variant U3 snoRNAs, and by testing their in vivo stabilities and activities, we identified the C'/D determinants needed for association of proteins Snu13p, Nop1p, Nop56p and Nop58p to U3 snoRNA. Based on a 3D structure model of U3 C/D box RNP built by C Charron, we then formulated hypotheses on the possible interactions between the C'/D motif and amino acids from Snu13p and Nop58p and verified the hypotheses by site-directed mutagenesis of yeast cell components. The data also revealed that very low amounts of U3 snoRNA are sufficient to ensure yeast growth. By site directed mutagenesis, I also studied how the C'/D and B/C motifs should be positioned one relative to the other in order to be functional. Taken together, my work brings important information on the architecture of yeast U3 snoRNP and its functional constraints