Mécanismes de l'internalisation du récepteur CCK2 : bases pharmacologiques et structurales

Magnan, Rémi

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Mécanismes de l'internalisation du récepteur CCK2 : bases pharmacologiques et structurales

par Rémi Magnan

Thèse de doctorat en Innovation pharmacologique

Sous la direction de Daniel Fourmy.

Soutenue en 2011

à Toulouse 3 .

Résumé

Le récepteur CCK2 est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG) possédant deux ligands naturels, la cholécystokinine et la gastrine, retrouvées au niveau du système nerveux central et du système gastro-intestinal. Le récepteur CCK2 est impliqué dans de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques dont les cancers. La présence membranaire des RCPG est hautement régulée notamment par le mécanisme d'internalisation après timulation par un agoniste. Les beta-arrestines initient l'internalisation de nombreux RCPG et sont également capables d'agir comme des protéines d'échafaudage permettant aux récepteurs d'émettre un signal indépendamment des protéines G. De plus, des ligands dits " biaisés " sont capables d'activer sélectivement les voies de transductions du signal dépendantes des protéines G ou dépendantes des beta-arrestines. Les mécanismes de l'internalisation du récepteur CCK2 n'étaient pas connus et nos objectifs ont été, dans un premier temps, de caractériser ces mécanismes, puis de montrer que des ligands synthétiques du RCCK2 possèdent une activité " biaisée " et enfin de caractériser la conformation du récepteur CCK2 recrutant les beta-arrestines. Dans ce travail, nous rapportons que l'internalisation du récepteur CCK2 est un phénomène faisant intervenir les beta-arrestines, la clathrine et la dynamine. Nous localisons la zone d'interaction des beta-arrestines sur le récepteur CCK2, en identifiant un groupe de sérinethréonine située dans la partie distale de l'extrémité C-terminale du récepteur. Cependant, l'utilisation de mutants du récepteur présentant un recrutement beta-arrestines défectueux ou de cellules invalidées pour les deux beta-arrestines montre que le récepteur CCK2 est toujours capable de s'internaliser, suggérant la présence d'un mécanisme alternatif. Nous identifions des ligands synthétiques du récepteur CCK2 avec une activité " biaisée " capables d'activer des voies de transduction dépendantes des protéines G mais ne recrutant pas les beta-arrestines. De plus, un ligand, le GV150,013X n'est pas capable d'inhiber le recrutement des beta-arrestines induit par la CCK alors qu'il inhibe la production d'inositol phosphate de façon compétitive. La mutation d'acides aminés suffit pour diminuer le recrutement des beta-arrestines au RCCK2 sans altérer sa capacité à activer la PLC. Ces résultats sont les premiers à montrer l'existence d'une conformation moléculaire d'un RCPG recrutant les beta-arrestines distincte de celle activant la voie dépendante de la protéine G. Les résultats de cette étude apportent des informations quant à la régulation pharmacologique de l'internalisation du récepteur CCK2 et supportent le concept de sélectivité fonctionnelle des RCPG.

Titre traduit

Mechanisms of CCK2R internalization : pharmacological and structural basis
Résumé

The CCK2 receptor (CCK2R) is a G-protein coupled receptor (GPCR) and binds to two different natural ligands, cholecystokinin and gastrin, which are mostly localized in the gastro-intestinal tract and the central nervous system. The CCK2 receptor is involved in various physiological and pathological processes including cancers. The localization of GPCR at the cell membrane is highly regulated notably by internalization of the receptors following agonist stimulation. The -arrestins initiate internalization of many GPCR and act as scaffolding proteins leading GPCR to trigger G-protein independent signal transduction. Recently, biased ligands have been discovered that selectively activates either G-protein or -arrestins mediated signaling pathways. The mechanisms of CCK2R internalization were not known and the purpose of our study was first to characterize these mechanisms and then to show that synthetic ligands of CCK2R may have a biased activity towards -arrestins recruitment. Finally, we aimed at characterizing a conformational state of the CCK2R recruiting -arrestins distinct from the state activating G-proteins. The CCK2 receptor (CCK2R) is a G-protein coupled receptor (GPCR) and binds to two different natural ligands, cholecystokinin and gastrin, which are mostly localized in the gastro-intestinal tract and the central nervous system. The CCK2 receptor is involved in various physiological and pathological processes including cancers. The localization of GPCR at the cell membrane is highly regulated notably by internalization of the receptors following agonist stimulation. The -arrestins initiate internalization of many GPCR and act as scaffolding proteins leading GPCR to trigger G-protein independent signal transduction. Recently, biased ligands have been discovered that selectively activates either G-protein or -arrestins mediated signaling pathways. The mechanisms of CCK2R internalization were not known and the purpose of our study was first to characterize these mechanisms and then to show that synthetic ligands of CCK2R may have a biased activity towards -arrestins recruitment. Finally, we aimed at characterizing a conformational state of the CCK2R recruiting -arrestins distinct from the state activating G-proteins. In this work, we report that internalization of CCK2R is a process involving both beta-arrestine1 and 2 as well as clathrin and dynamin. We characterized the binding site of -arrestin on CCK2R, by identifying a cluster of serine/threonine in the distal part of the receptor C-terminus. However, CCK2R mutants lacking this region or receptors expressed in cells deleted of both -arrestins still displayed strong internalization of receptors suggesting the existence of an alternative mechanism that does not require -arrestins. We also identified synthetic ligands of CCK2R that display biased activity, by activating G-protein mediated signaling pathways without recruiting -arrestins. Furthermore, a CCK2R ligand, GV150,013X was not able to inhibit CCK-induced -arrestins recruitment whereas it acts as a potent competitive antagonist on CCK-induced inositol phosphates production. Else, the mutation of specific single amino acid into the binding site of CCK2R was sufficient to significantly reduce -arrestins recruitment without altering CCK-induced G-protein mediated signaling pathways. To our knowledge, these results show for the first time, that a GPCR conformational state recruiting b-arrestins is different from a state activating G-proteins. This study brings new insights into the pharmacological regulation of CCK2R internalization and strongly supports the concept of "functional selectivity".