Caractérisation d’inhibiteurs de complexes CDK‐cycline chez Arabidopsis thaliana

Characterisation of Arabidopsis thaliana cyclin dependent kinase inhibitors

• Auteur / Autrice : Laurine Millan
• Direction : Nathalie Glab-Perret
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie végétale
• Date : Soutenance le 27/09/2011
• Etablissement(s) : Paris 11
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole doctorale Sciences du Végétal (1992-2015 ; Orsay, Essonne)
• Partenaire(s) de recherche : Institut : Institut de Biologie des Plantes (Orsay, Essonne ; 1994-2014)
• Jury : Président / Présidente : Michaël Hodges
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Nathalie Glab-Perret, Michaël Hodges, Mohammed Bendahmane, Éric Monfroy, Séverine Planchais
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Mohammed Bendahmane, Éric Monfroy

Mots clés

Mots clés contrôlés

Arabidopsis thaliana

Inhibiteurs

Kinases dépendantes des cyclines

Cycle cellulaire végétal

Mots clés libres

Cycle cellulaire

Inhibiteurs de CDK-cycline

Arabidopsis thaliana

Développement floral

Criblage double-hybride

Cell cycle

CDK inhibitor

Arabidopsis thaliana

Floral development

Two-hybrid screen

Résumé

Comme pour tous les organismes pluricellulaires, la croissance et le développement des plantes nécessitent une coordination de la production de cellules via la mitose et la différenciation cellulaire. La progression du cycle cellulaire est contrôlée par les complexes CDK-cycline. Les inhibiteurs de ces complexes, les CKIs, représentent d’excellents candidats pour réguler cet équilibre entre les processus de prolifération et différentiation cellulaires qui ont lieu au cours du développement. Afin de mettre en évidence le rôle d’intégrateurs potentiel des CKIs, le développement floral a été utilisé en tant que modèle.Grâce à l’utilisation de la qRT-PCR, nous avons montré que durant le développement floral d’Arabidopsis thaliana, un groupe restreint de CKIs était exprimé. Nous avons choisi de travailler sur les deux CKIs les plus exprimés, KRP6 et KRP7. Une caractérisation fine de leur profil d’expression durant le développement a été réalisée en utilisant des approches complémentaires telles que l’analyse de l’activité de leur promoteur, de la dynamique de leur transcrit, de leur expression protéique et de leur régulation post-traductionnelle.Jusqu’à présent, seules des approches ‘gain de fonction’ ont été utilisées pour étudier le rôle des CKIs chez les plantes. C’est pour cela que nous avons choisi des approches ‘perte de fonction’ pour analyser le rôle de KRP6 et de KRP7 au cours du développement floral. Ainsi, nous avons généré des doubles mutants d’insertion krp6-krp7, krp3-krp6, krp3-krp7, des triples mutants d’insertion krp3-krp6-krp7 et diverses lignées ARN interférence avec des promoteurs spécifiques. Malgré l’étude de ces nombreuses lignées, nous n’avons pas réussi à mettre en évidence des effets phénotypiques associés à l’absence de la fonction CKI au cours du développement floral. Ces résultats mettent en évidence la redondance fonctionnelle qui semble exister entre les KRPs, ainsi un quadruple mutant pourrait être nécessaire pour entrainer des modifications développementales. Afin de mieux comprendre cette fonction d’intégrateurs des KRPs au cours du développement floral, les partenaires de KRP6 et de KRP7 ont été recherchés. Des criblages double-hybride ont été réalisés afin d’identifier des ADNc, spécifiques du développement floral, codant des protéines capables d’interagir avec KRP6 et KRP7. De façon intéressante, mis à part les cyclines de type D, un nouveau type d’interaction a pu être mis en évidence. Un sous-groupe de la famille des rémorines est capable d’interagir avec KRP6 ou KRP7 en système double-hybride. Les rémorines sont des protéines spécifiques du règne végétal, associées à la membrane plasmique mais dont la fonction reste à clarifier. Une approche BiFC en protoplastes BY-2 a permis de confirmer l’existence de ce type d’interaction. De plus, l’influence des rémorines sur la localisation intracellulaire des KRPs a été étudiée. En présence de ces nouveaux partenaires, KRP7 est capable d’adopter une localisation nucléo-cytoplasmique.Enfin, des résultats récents ont montré que l’AMPK était capable de phosphoryler p27KIP1, l’homologue fonctionnel des KRPs chez les mammifères. Ces évènements de phosphorylation entrainent des modifications de sa localisation intracellulaire et de son activité inhibitrice vis-à-vis des complexes CDK-cycline. Après la réalisation d’analyses in silico ayant permis de prédire des sites putatifs de phosphorylation par SnRK1, l’homologue de l’AMPK chez A. thaliana, pour certains KRPs, la protéine KRP6 sous forme recombinante a été utilisée pour réaliser des essais kinase in vitro. Une phosphorylation de KRP6 est détectée en présence de la sous unité catalytique activée de SnRK1. Contrairement aux mammifères, cet évènement de phosphorylation entraine une altération de l’activité inhibitrice de KRP6 sans modification de sa localisation intracellulaire. Cette abolition de l’activité de KRP6 a été confirmée in planta. En effet, les phénotypes associés à la surexpression de KRP6 peuvent être atténués par la surexpression simultanée de la sous-unité catalytique de SnRK1. L’existence de ce lien entre KRP6 et SnRK1 met en évidence une relation directe entre l’homéostasie énergétique et la prolifération cellulaire.

As in all multicellular organisms, growth and development in plants require the coordination of cell production by division and cell differentiation. Progression through cell cycle is controlled by the kinase activity of CDK/cyclin complexes. Inhibitors of these complexes, CKIs, represent excellent candidates to regulate the balance between proliferation and differentiation processes during development. To get insight in the potential integrator role of CKIs, floral development was chosen as a developmental model. Using a real time quantitative PCR approach, we bring to light that during floral development of Arabidopsis thaliana, a restricted subset of CKIs was preferentially expressed. It was decided to focus our work on the two major expressed CKIs, KRP6 and KRP7. A better characterization of their expression patterns of during development was undertaken using complementary approaches such as promoter activity analysis, mRNA dynamics, protein expression and post-translational regulation analysis. Because until now ‘gain of function’ approaches have been largely applied to unravel the role of plant CKIs, our challenge was to detect a floral phenotype for KRP6 and KRP7 loss of function mutants, either using knock-out mutants or RNAi lines. We generated krp6-krp7, krp3-krp6, krp3-krp7 double mutants and krp3-krp6-krp7 triple mutant and also several RNAi lines with specifics promoters. Despite the study of these numerous lines, we were not able to highlight phenotypic effects associated with the absence of CKI function during floral development. All these results emphasis functional redundancy which appears to exist between all KRPs, thus quadruple mutant might be needed to provoke some developmental modification.In order to better understand the integrative function of KRPs during floral development, partners of KRP6 and KRP7 were assessed. Two-hybrid screens were performed to identify cDNAs from a “floral-buds-development” library encoding proteins that are able to interact with KRP6 and KRP7. Interestingly, apart from D-type cyclins, we brought to light a new type of interaction. Indeed, a sub-class of the remorin protein family was able to interact with KRP6 or KRP7 in yeast two-hybrid. Remorins are plant specific plasma membrane associated proteins with unknown function. A BiFC approach in BY-2 protoplasts allowed us to confirm remorins/KRP6-7 interactions. Furthermore, the influence of the presence of remorin proteins on KRP6/7 localisation was assessed. KRP7 is able to adopt a nucleo-cytoplasmic localisation in presence of its new partners.Finally, recent results have shown that AMPK is phosphorylating p27KIP1, KRPs functional counterpart in mammals. These phosphorylation events lead to changes in its cellular localisation and its inhibitory activity toward CDK-cyclin complexes. After in silico analysis aiming to predict potential AMPK Arabidopsis homologue SnRK1 phosphorylation sites within some KRPs protein sequences, recombinant KRP6 was used in order to perform in vitro kinase assays. Phosphorylation occurs efficiently on KRP6 when activated SnRK1 catalytic subunit is present. Furthermore, unlike in mammals, this phosphorylation event leads to an alteration of KRP6 inhibitory activity without modification of its cellular localisation. This abolition of KRP6 activity was confirmed by in planta analysis. Indeed, KRP6 overexpression phenotype can be attenuated by simultaneous SnRK1 catalytic subunit overexpression. The existence of this link between KRP6 and SnRK1 underscores a direct relationship between energy homeostasis and cell proliferation.