Susceptibilité de la muqueuse intestinale aux xénobiotiques : implication dans la physiopathologie des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) : exemple du gène Rac1

Susceptibility of intestinal mucosa to xenobiotics : role in the physiopathology of inflammatory bowel diseases (IBD) : example of Rac1 gene

• Auteur / Autrice : Joanna Bourgine
• Direction : Michel Imbenotte
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie et biologie moléculaire
• Date : Soutenance le 24/10/2011
• Etablissement(s) : Lille 2
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Lille ; 2000-....)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Facteurs de transcription

Régions promotrices (génétique)

Polymorphisme génétique

Protéine G rac1

Transporteurs ABC

métabolisme

Enzymes

Analyse de profil d'expression de gènes

Maladies inflammatoires intestinales

Dissertations académiques

Muqueuse intestinale

Promoteurs (génétique)

Polymorphisme génétique

Transporteurs ABC

Enzymes -- Métabolisme

Muqueuse intestinale

Mots clés libres

MICI

Tap Man TM Low Density Arrays

Résumé

Les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI) regroupent la maladie de Crohn (MC) et la Rectocolite Hémorragique (RCH), deux maladies qui se caractérisent par l’inflammation de la paroi d’une partie du tube digestif, source de lésions destructrices (ulcérations). Ces pathologies complexes sont influencées par de multiples facteurs génétiques et environnementaux. D’une part, de nombreux gènes de susceptibilité pour ces maladies ont été identifiés, mais ils ne permettent d’expliquer qu’une fraction mineure du développement des MICI. D’autre part, certaines études montrent qu’un dysfonctionnement du processus de prise en charge des xénobiotiques dans la muqueuse digestive peut jouer un rôle dans l’initiation et/ou la progression des MICI. Notre travail a consisté, dans un premier temps, en l’étude du profil d’expression de gènes codant pour des protéines impliquées dans le métabolisme et le transport des xénobiotiques. Une stratégie de RT-PCR quantitative en temps réel, permettant l’analyse simultanée de l’expression de 377 gènes, a été utilisée. Cette analyse a été réalisée sur des échantillons de muqueuse intestinale de sujets témoins et de patients atteints de MC, ainsi que sur cinq lignées de cellules épithéliales intestinales.Cette étude a permis d’identifier les systèmes de prise en charge des xénobiotiques présents dans la muqueuse intestinale saine. Des profils d’expression différents ont été mis en évidence entre les tissus intestinaux sains et inflammatoires, mais également entre les tissus intestinaux et les lignées cellulaires intestinales, ce qui suggère des différences majeures dans les processus de prise en charge cellulaire des xénobiotiques, et, par conséquent des différences de susceptibilité à l’effet des composés toxiques exogènes. Dans un second temps, la petite protéine G, Rac1, a été étudiée. Cette protéine est impliquée dans la réparation des ulcérations de l’épithélium intestinal et a récemment été identifiée comme la cible des métabolites actifs des médicaments thiopuriniques, largement prescrits dans le traitement des MICI. La nature et l’étendue de la variabilité de la séquence nucléotidique du gène Rac1 a été évaluée, chez des volontaires sains et des patients atteints de MICI, à l’aide d’une stratégie basée sur le couplage de l’analyse du polymorphisme de conformation de fragments d’ADN simple brin générés par réaction de polymérisation en chaine (PCR-SSCP) et du séquençage. Des études in silico et in vitro des conséquences fonctionnelles des polymorphismes d’intérêts ont ensuite été effectuées dans des lignées cellulaires intestinales (HT29 et Caco-2) et lymphocytaires (Jurkat). Cela nous a conduits à mieux caractériser le promoteur de Rac1 par une analyse de délétion séquentielle et par des techniques de ChIP et d’EMSA.Cette étude nous a permis de démontrer pour la première fois l’existence de polymorphismes génétiques fonctionnels de Rac1 et d’identifier son promoteur minimal, ainsi que des facteurs de transcription à l’origine de la régulation de cette protéine.

Crohn’s disease (CD) and Ulcerative colitis (UC) are chronic inflammatory bowel diseases (IBD) of the gastrointestinal tract. These are multifactorial polygenic diseases with probable genetic heterogeneity. An emerging concept suggesting that dysfunction(s) of the processing of xenobiotics in the intestinal mucosa may be an important event in the initiation and progression of IBD has been discussed. Firstly, in this study, a precise and reliable characterization of the global expression profile of genes which code enzymes, transporters and nuclear factors involved in the processing of xenobiotics has been performed in intestinal epithelium of controls or patients with IBD, and in 5 intestinal cell lines. A quantitative real-time RT-PCR analysis using TaqMan Low Density Arrays (TLDA) was performed to simultaneously measure the expression of 377 genes.This work has identified genes encoding proteins that are involved in the metabolism and the disposition of xenobiotics in the healthy intestinal mucosa. Different genes expression profile between healthy and inflammatory intestinal tissues and between healthy intestinal tissues and intestinal cell lines were found. These tissues will consequently display distinctive susceptibility toward environmental chemicals and their toxic effects.Secondly, the small G protein, Rac1, which regulates cutaneous and mucosal intestinal wound healing and is identified as a target of active metabolites of thiopurine drugs, used in the treatment of IBD, has been studied. We searched for sequence variations by analysing the nucleotide sequence of the promoter and the coding sequence of Rac1 in genomic DNA from healthy volunteers and patients with IBD, using a PCR-single strand conformation polymorphism (SSCP) strategy and sequencing. The functional consequences of variations, that have been identified, were then analysed in silico and in vitro, in human intestinal cell lines (HT29 and Caco-2) and leukemia T-lymphocyte cell line (Jurkat). Via various deletion constructs, a putative regulatory region was identified and characterized further by chromatin immunoprecipitation and electrophoretic mobility shift assays.This work provides the first evidence that a functional genetic polymorphism of Rac1 activity exists. Furthermore, this study characterizes the proximal promoter of Rac1 gene and demonstrates the presence of consensus binding sites for numerous transcription factors, which could influence gene expression.