Identification of p53 isoforms and characterisation of their biological activities in cancer and normal cells

par Marie El Khoury

Thèse de doctorat en Cancérologie

Sous la direction de Jean-Christophe Bourdon et de Anne-Catherine Prats.

Soutenue en 2010

à Toulouse 3 en cotutelle avec Dundee .

  • Titre traduit

    Identification des isoformes de p53 et caractérisation de leurs activités biologiques dans des cellules cancéreuses et normales


  • Résumé

    Le gardien du génome p53 est un facteur de transcription qui joue un rôle clé dans la maintenance de la stabilité génétique, empêchant ainsi la formation des cancers. Vingt-cinq ans après sa découverte, nous avons mis en évidence que, comme les deux autres membres de la famille p53, le gène p53 humain a une structure double : deux gènes en un, codant pour au moins 9 isoformes de la protéine p53. Notre laboratoire et d'autres groupes ont établi que p53beta and Delta133p53alpha peuvent moduler l'activité transcriptionnelle de p53 en fonction des promoteurs et des stress cellulaires. Nous rapportons dans cette thèse qu'en réponse au stress, p53 transactive son promoteur interne induisant ainsi l'expression de Delta133p53alpha. Cette isoforme va alors moduler différentiellement l'expression des gènes cibles de p53, inhibant l'apoptose induite par p53 et l'arrêt du cycle cellulaire en G1, sans inhiber l'arrêt du cycle en G2. Notre laboratoire et d'autres groupes ont également démontré que les isoformes de p53 sont différemment exprimées dans plusieurs types de cancer, dont le cancer du sein. Par conséquent, nous avons analysé dans cette thèse les expressions de p53beta et p53gamma, isoformes de p53 normalement exprimées dans le sein, en relation avec les marqueurs cliniques et pathologiques dans une cohorte de 127 tumeurs primaires du sein. Notre étude de l'expression de p53gamma a permis de mettre en évidence deux populations de patientes présentant une tumeur mutée pour p53 : une population présentant un bon pronostique et une population présentant un mauvais pronostique de survie. La détermination de l'expression des isoformes de p53 pourrait alors aider à associer les données cliniques au statut mutationnel de p53 et ainsi améliorer le traitement des patients atteints de cancer. Après avoir confirmé que la structure de deux gènes en un de p53 est conservée dans les gènes p53 du poisson zèbre et de la drosophile, nous avons revisité le gène p53 de souris afin de déterminer la relevance physiologique des isoformes de p53 durant le développement embryonnaire, le vieillissement et la carcinogenèse. Nous avons établi que le gène p53, en incluant les isoformes précédemment décrites (FLp53, Delta40p53 (obtenue par initiation alternative de la traduction) et p53AS), code pour 6 protéines isoformes (p53, p53AS, Delta40p53, Delta40p53AS, Delta157p53 and Delta157p53AS) par épissage alternatif, usage d'un promoteur interne et initiation alternative de la traduction. La conservation au cours de l'évolution de la structure génique suggère que les isoformes de p53 jouent un rôle important dans les activités anti-tumorales de p53. Dans le but de déterminer leur(s) activité(s) biologique(s) dans des conditions physiologiques, nous avons développé des outils scientifiques nécessaires à l'étude des isoformes de p53 de souris. Après clonage et séquençage, nous avons identifié un nouvel épissage alternatif de l'intron 2 du gène p53 de souris, conduisant à l'expression des isoformes Delta40p53. Par ailleurs, nous montrons que les isoformes de p53 murines peuvent réguler l'activité promotrice des promoteurs de Bax et MDM2 d'une manière dépendante et indépendante de p53. Nos résultats initiés dans les cellules souches de souris ont montré que certains isoformes de p53 sont différentiellement exprimées durant la différenciation des cellules souches en kératinocytes ou en neurones, conduisant à une régulation différentielle des gènes cibles de p53. Ceci suggère que les isoformes de p53 jouent un rôle important dans la différenciation des cellules souches. La découverte des isoformes de p53 pourrait aider à mieux comprendre le rôle de p53 dans la carcinogenèse et pourrait constituer une nouvelle cible thérapeutique pour contrôler les activités anti-tumorales de p53.


  • Résumé

    The "guardian of the genome" p53 is a transcription factor with a key role in the maintenance of genetic stability thus preventing cancer formation. 25 years after its discovery it was revealed that like the two other p53 family gene members, the human p53 gene has a dual gene structure encoding at least 9 different p53 protein isoforms. Our laboratory and others have established that p53beta and Delta133p53alpha isoforms can modulate p53 transcriptional activity in a promoter and stress-dependent manners. We report in this thesis that in response to stress, p53 transactivates its internal promoter in intron 4 and the induced Delta133p53alpha protein differentially modulates p53 target gene expression, inhibiting p53-mediated apoptosis and G1 cell cycle arrest without inhibiting G2 cell cycle arrest. Our laboratory and others have also demonstrated that the p53 isoforms are differentially expressed in several types of cancer including breast cancer. We therefore analysed in this thesis the expression of p53beta and p53gamma, the p53 isoforms normally expressed in breast tissue, in relation to clinical and pathological markers in a cohort of 127 primary breast tumours. Our results show that p53gamma expression enable us to identify two subpopulations of patients bearing mutant p53 breast tumours, one with good prognosis and one with poor prognosis. The determination of p53 isoforms' expression may help link clinical outcome to p53 status and improve cancer patient treatment. After having confirmed that the dual gene structure is conserved in zebrafish and in Drosophila p53 genes, we re-visited the mouse p53 gene in order to determine the physiological relevance of the p53 isoforms during embryonic development, ageing and carcinogenesis. We established that including the previously described isoforms (FLp53 Delta40p53 (obtained by alternative initiation of translation) and p53AS), the mouse p53 gene encodes 6 different p53 proteins (p53, p53AS, Delta40p53, Delta40p53AS, Delta157p53 and Delta157p53AS), due to alternative splicing, alternative promoter usage and alternative initiation of translation. The conservation through evolution of the dual gene structure suggests that the p53 isoforms play an important role in p53 tumour suppressor activity. With the aim of determining their biological activities under physiological conditions, we developed primers, expression vectors and specific siRNAs for mouse p53 isoforms. Nested PCRs and DNA sequencing enabled us to identify a novel alternative splicing of intron 2 of the mouse p53 gene leading to the expression of the Delta40p53 isoforms. Additionally, we show evidence that mouse p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity on the Bax and MDM2 promoters. Our preliminary results in mouse embryonic stem cells reveal that some p53 isoforms are differentially regulated during stem cell differentiation leading to a differential expression of p53 target genes. This suggests that p53 isoforms play an important role in ES cell differentiation. The discovery of the p53 isoforms may help to better understand the role of p53 in carcinogenesis and may constitute a therapeutic target to regulate p53 tumour suppressor activities.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (181 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 160-181

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  • Bibliothèque : Université Paul Sabatier. Bibliothèque universitaire de sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 2010 TOU3 0339
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