Mise en évidence d'une interaction fonctionnelle bidirectionnelle entre le récepteur GABA-A et le récepteur du peptide vasoactif urotensine II : implication potentielle dans la fonction astrocytaire

par Thomas Lefebvre

Thèse de doctorat en Biologie cellulaire

Sous la direction de Hélène Castel.

Le jury était composé de Bruno Gonzalez, Xavier Leroy, Marie-Christine Tonon.

Les rapporteurs étaient R Vazquez, Laurent Prézeau.


  • Résumé

    Longtemps considérés comme de simples cellules de soutien dans le système nerveux central (SNC), les astrocytes jouent en réalité un rôle clef au sein de l’unité neurovasculaire dans la régulation métabolique, la transmission synaptique et/ou la neurogenèse et la synaptogenèse via l’expression de nombreux récepteurs/canaux ioniques/transporteurs et la libération de facteurs autocrine et paracrine. A la suite de lésions cérébrales, en particulier après un épisode ischémique, l’astrocytose réactionnelle qui se met alors en place pourrait être contrôlée par des facteurs vasoactifs localement surexprimés. L’urotensine II (UII) et son paralogue l’urotensin II-related peptide (URP) sont deux neuropeptides cycliques considérés comme les facteurs endogènes vasoactifs les plus puissants caractérisés à ce jour. Les travaux réalisés dans notre équipe ont mis en évidence la présence des ARNm codant l’UT et la protéine dans les astrocytes corticaux de Rat en culture, et ont montré que l’UII active les voies Gq-PLC-Ca²⁺, Gi/o, ou des canaux calciques de type T, et stimule la prolifération astrocytaire. Les différences d’affinité de l’UT pour l’UII et l’URP, et ses différents couplages pourraient s’expliquer par des phénomènes de plasticité dépendants de l’état de prolifération astrocytaire, eux-mêmes sous-tendus par des interactions physiques et/ou fonctionnelles avec d’autres récepteurs. Un exemple de plasticité « récepteur » a été suggéré pour le récepteur GABA-A, dont l’expression fonctionnelle à la membrane plasmique est inversement proportionnelle à la capacité de prolifération des astrocytes, après un accident vasculaire cérébral ou dans des tumeurs astrocytaires malignes. Ces données suggèrent donc que le récepteur GABA-A est récepteur « répresseur » de prolifération cellulaire. Une étude montrant que l’UII régule la fonction GABAergique dans les neurones d’Aplysie, permettait d’envisager l’existence d’une interaction entre les effets mitogènes de l’UII et répresseur du GABA sur la prolifération astrocytaire en conditions physiopathologiques. Notre projet de recherche a donc consisté 1) à montrer que l’UT et le récepteur GABA-A sont co-exprimés dans les astrocytes et à rechercher l’existence d’une interaction fonctionnelle bidirectionnelle entre les deux récepteurs dans ce modèle cellulaire, 2) à caractériser le mécanisme d’action de l’UII sur l’activité GABAergique dans les astrocytes de cervelet en co-culture avec des neurones, et dans une lignée co-exprimant l’UT et les sous-unités du récepteur GABA-A humain, et 3) à identifier les séquences d’interaction permettant le rapprochement de l’UT au récepteur GABA-A, et sa régulation fonctionnelle. Sur des astrocytes corticaux de Rat en culture, nous avons montré pour la première fois que l’UII entraîne une augmentation concentration-dépendante de la production d’AMPc. Cet effet est totalement bloqué par le SQ22536, un inhibiteur d’adénylyl cyclase, alors qu’il est exacerbé en présence d’un inhibiteur de PKA, le H89, suggérant l’existence d’un rétrocontrôle négatif du système adénylyl cyclase /AMPc/PKA sur la fonction de l’UT. De plus, l’UII stimule de façon concentration-dépendante le métabolisme des polyphosphoinositides (PIPs), un effet qui est fortement inhibé en présence de H89. L’ensemble de ces données suggère donc que l’UII entraîne la production d’AMPc et l’activation d’une PKA, qui pourrait catalyser le changement de couplage de l’UT des protéines Gs aux protéines Gi d’une part et Gq d’autre part. Enfin, nous avons démontré que l’activation du récepteur GABA-A inhibe les effets de l’UII sur le métabolisme des PIPs ainsi que sur la production d’AMPc, révélant l’existence d’une régulation négative de la fonction urotensinergique par le récepteur GABA-A dans les astrocytes. Des expériences de double marquage réalisées sur des tranches de cervelet de Rat révèlent que l’UT et les sous-unités γ1 et γ2 du récepteur GABA-A sont principalement co-exprimés au sein de fibres astrocytaires dans la couche moléculaire ainsi que dans les cellules de Purkinje. Sur des co-cultures astrocytes/neurones de cervelet, l’UT et les sous-unités γ1 et γ2 sont majoritairement exprimés dans les astrocytes. Dans ce modèle de co-culture, nous avons montré que l’UII inhibe la dépolarisation membranaire et atténue de manière concentration-dépendante l’amplitude du courant chlore évoqué par l’agoniste du récepteur GABA-A, l’isoguvacine. Sur les lignées CHO exprimant stablement l’UT humain (CHO-UT) et transitoirement transfectées par différentes combinaisons ADNc codant différentes sous-unités du récepteur GABA-A humain, l’UII 1) inhibe significativement l’amplitude du courant Cl- dès la concentration de 10¯¹³ M (β3γ2 ≈ α2β3γ2≈ α2β1γ2 > α2β3γ1 > α2β1γ1), 2) est d’autant plus puissant que la sous-unité γ est associée à la sous-unité β3 du complexe GABAergique (α2β3γ2 ≈ α2β1γ2 >> α2β3 ≈ α2β1) et 3) devient inactif lorsque les sous-unités γ ne sont pas associées au récepteur GABA-A. Sur les cellules CHO-UT exprimant le complexe α2β3γ2, l’UII, perfusée pendant seulement 1 s, est déjà capable d’entraîner une diminution du courant, un effet qui est corrélé aux effets du DMCM, un modulateur allostérique direct de la fonction des complexes GABAergiques composés des sous-unités γ. A l’aide d’un système d’imagerie dynamique, nous montrons que l’UII entraîne une augmentation irréversible de la concentration cytosolique de calcium ([Ca²⁺]c) alors l’URP stimule transitoirement la [Ca²⁺]c dans les CHO-UT. De même, l’UII et l’URP inhibent irréversiblement et réversiblement le courant chlore évoqué par l’isoguvacine, respectivement. Nous montrons que l’antagoniste peptidique [Orn⁵]-URP, se comporte comme un agoniste partiel de l’UT sur la [Ca²⁺]c et sur la fonction GABAergique capable de bloquer les effets prolongés de l’UII sur ces deux effecteurs. De plus, le palosuran, un antagoniste non-peptidique développé par Actélion, ne présente pas d’activité propre, abolit totalement l’effet de l’UII sur la [Ca²⁺]c mais en revanche, inhibe significativement la fonction GABAergique, mimant ainsi les effets de l’UII. L’effet de l’UII, caractérisé par une inhibition rapide (<1 s après l’application d’UII), suivie d’une diminution progressive de l’amplitude du courant au cours du temps, n’est pas relayé par les protéines G associées à l’UT. En revanche, l’inhibition observée à long terme est partiellement dépendante du calcium, des kinases/phosphatases intracellulaires, et met en jeu la dynamine, une protéine classiquement impliquée dans le processus d’internalisation du récepteur GABA-A. Nous confirmons en effet que sur des CHO exprimant l’UT et les sous-unités α2β3ᴴᴬ γ2, l’UII provoque l’internalisation du récepteur GABA-A. A l’aide de 4 mutants de l’UT délétés dans la partie C-terminale de 19 (UT370), 38 (UT351), 57 (UT332) et 70 (UT319) acides aminés, respectivement, nous montrons que lorsque le récepteur GABA-A est co-exprimé avec le mutant tronqué UT370, l’effet rapide de l’UII est fortement réduit et l’inhibition à long terme du courant chlore est retardée, suggérant que le fragment distal 370-389 relaye l’effet rapide et direct de l’UII. Lorsque le récepteur GABA-A est co-exprimé avec les mutants UT351, UT352 ou UT319, l’UII est sans effet sur la régulation du courant GABA-A, indiquant que la séquence comprise entre les acides aminés 351 et 370 joue un rôle majeur dans le processus d’internalisation du récepteur GABA-A. L’ensemble de ces données démontre pour la première fois l’existence d’une interaction fonctionnelle bidirectionnelle entre le récepteur GABA-A et le récepteur couplé aux protéines G de l’UII, associée particulièrement à la plasticité astrocytaire. L’activation de l’UT inhibe rapidement la fonction GABAergique, conduisant à l’extinction progressive du récepteur GABA-A à la membrane plasmique via son internalisation. Les effets de l’UII, partiellement indépendants des voies de signalisation classiquement associées aux RCPG, suggèrent l’existence d’un couplage « direct » entre le fragment C-terminal de l’UT et la sous-unité γ associée au complexe récepteur GABA-A. De fait, la perte du rôle répresseur du récepteur GABA-A ngendrée par le peptide vasoactif UII pourrait jouer un rôle majeur dans la prolifération astrocytaire au cours de lésions cérébrales.


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Informations

  • Détails : 1 vol. (353 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. 881 références

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  • Bibliothèque : Université de Rouen Normandie. Service commun de la documentation. Section Sciences et Techniques (site du Madrillet).
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 10/ROUE/S050
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