Analyse structurale et fonctionnelle du pseudopilus assemblé par le système de sécrétion de type II de Klebsiella oxytoca

par Manuel Campos

Thèse de doctorat en Microbiologie

Sous la direction de Olivera Francetic.

Soutenue en 2010

à Paris 7 .


  • Résumé

    Nombre de bactéries à Gram négatif sécrètent à l'aide d'un système de sécrétion de type 2 (SST2) des toxines et des hydrolases. Dans certaines conditions, le SST2 peut assembler des pili à la surface des bactéries composés de pseudopilines. Ces filaments dynamiques sont probablement confinés à l'espace périplasmique et jouent un rôle essentiel dans le processus de sécrétion. Le pseudopilus pourrait fonctionner comme un piston poussant le substrat à travers le canal dans la membrane externe, ou induire des changements conformationnels dans le système de sécrétion aboutissant à la sécrétion du substrat. L'objectif de ce travail a été de déterminer la structure, et de comprendre l'assemblage du pseudopilus par le SST2 de Klebsiella oxytoca. PulG est la sous-unité principale du pseudopilus. Nous avons généré une série de modèles du pilus à une résolution pseudo-atomique par une nouvelle procédure de docking. Les interactions électrostatiques prédites ont été validées par mutagenèse dirigée en inversant des charges et par pontage disulfure. L'analyse de la pseudopiline majeure PulG par mutagenèse dirigée a permis par ailleurs d'isoler des variants permettant de découpler la sécrétion de la piliation ou affectés très tôt dans leur voie de biogenèse. En outre, les distances entre acides aminés dans le cœur du pilus ont été évaluées par pontage disulfure en substituant par des cystéines 2 acides aminés de chaque segment transmembranaire de PulG. Nous avons ainsi pu non seulement valider les modèles, mais aussi tester pour la première fois l'assemblage du pseudopilus dans le périplasme, et tester le rôle des différents facteurs de sécrétion dans la biogenèse du pseudopilus.

  • Titre traduit

    Structural and functional analysis of the pseudopilus assembled by the type II secretion System of Klebsiella oxytoca


  • Résumé

    Many Gram-negative bacteria secrete specific proteins to the extracellular milieu via the type II secretion Systems (T2SS). Under specific conditions, T2SS assemble pili on the bacterial surface, composed of pseudopilins. These dynamic filaments, called the pseudopili, are localized in the periplasm and play an essential role in protein secretion. They could act as a piston to push the protein substrate through the channel in the outer membrane, or drive conformational changes of secretion System components involved in the channel gating. The objective of this work was to determine the structure and understand the assembly of the pseudopilus from the pullulanase-specific T2SS of Klebsiella oxytoca. PulG is the main subunit of the pseudopilus. Pseudo-atomic resolution models were generated by a new flexible docking procedure, using ambiguous distance restraints. Predicted electrostatic interactions were validated by introducing single deleterious and double compensatory charge inversions. Extensive mutational analysis of the major pseudopilin PulG led to the isolation of variants allowing for uncoupling secretion and piliation, or affected in early steps of their biogenesis. In addition, inter-residue distances in the pilus core were probed using double cysteine substitutions in the PulG TMS, followed by cross-linking. This approach allowed us not only to validate the models, but also provided a biochemical tool to probe the assembly of the so-far elusive periplasmic pseudopilus. Using covalent cross-linking we could test the role of different T2SS components in thé pseudopilus biogenesis.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (194 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : 299 réf.

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  • Bibliothèque : Université Paris Diderot - Paris 7. Service commun de la documentation. Bibliothèque Universitaire des Grands Moulins.
  • PEB soumis à condition
  • Cote : TS (2010) 139
  • Bibliothèque : Bibliothèque interuniversitaire de santé (Paris). Pôle pharmacie, biologie et cosmétologie.
  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : MFTH 8004
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