Etude de la réponse humorale neutralisante contre le Virus de l’Hépatite C

Study of the neutralizing antibody response against the hepatitis C virus

• Auteur / Autrice : Ndiémé Ndongo Thiam
• Direction : Marie-Anne Petit
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire intégrative et cellulaire
• Date : Soutenance le 11/02/2010
• Etablissement(s) : Lyon 1
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de Biologie Moléculaire Intégrative et Cellulaire (Lyon)
• Jury : Président / Présidente : Christian Trépo
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Geneviève Inchauspé, Emmanuel Drouet
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Françoise Stoll-Keller, Patrick Maurel

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cellules hépatiques

Anticorps monoclonaux

Glycoprotéines

Virus de l'hépatite C

Mots clés libres

Virus de l’hépatite C

Glycoprotéines d’enveloppe

Anticorps monoclonal

Neutralisation

Cellules hépatocytaires

Hepatitis C virus

Envelope glycoproteins

Monoclonal antibody

Neutralisation

Human hepatocytes

Résumé

Le virus de l’hépatite C (HCV) est l’agent responsable de l’hépatite C, maladie qui touche environ 3% de lapopulation mondiale. Une des caractéristiques de cette infection est son évolution dans 60 à 90% des casvers des formes chroniques avec des complications sévères telles que la cirrhose et le carcinomehépatocellulaire. Un des handicaps majeurs de la recherche sur le HCV est l’absence de systèmes decultures in vitro efficaces et de modèles animaux adaptés car le HCV n’infecte que l’homme et le chimpanzé.l’anticorps D32.10. Pour cela, nous avons développé un test de cellbindinget nous avons montré quel’interaction des particules virales sériques (HCVsp) radiomarquées à l’Iode 125 avec les celluleshépatocytaires (Huh‐7 et HepaRG) est spécifique et saturable impliquant des sites de haute et faible affinité.De plus, l’anticorps D32.10 est capable d’inhiber spécifiquement et efficacement les interactions de hauteaffinité entre les HCVsp et les cellules HepaRG avec une IC50 ≤ 0,5 μg/ml. Nous avons mis en évidence quel’inhibition est plus efficace lorsque nous utilisons sélectivement une population de particules HCVenveloppées exprimant fortement E1E2. Récemment, nous avons développé un système d’infection originaldes cellules HepaRG qui sont des cellules progénitrices du foie par les HCVsp et avons montré quel’infection, la réplication et la propagation dépendent de l’état de prolifération/différenciation de cescellules. Nous avons aussi démontré que les particules virales produites dans ce système contiennent del’ARN viral, expriment les protéines d’enveloppe E1E2 et sont infectieuses. Des études préliminairesmontrent que l’anticorps D32.10 inhibe fortement l’infection (95% à 80% aux jours 14 et 21 aprèsinfection) vraisemblablement au niveau des étapes précoces du cycle viral.Dans un second temps, nous avons recherché la prévalence des anticorps de même spécificité que le D32.10(anti‐E1E2A,B) dans différents groupes de patients HCV positifs afin de déterminer leur significationbiologique. Par un test ELISA utilisant les peptides biotinylés E1, E2A et E2B dans la phase de capture, nousavons démontré que la réponse anticorps anti‐E1E2A,B était présente dans 90% des cas chez les patientsqui guérissent spontanément avec des titres élevées (≥ 1/1000). Cette réponse humorale est absente ourare (< 10%) chez les patients porteurs chroniques non traités ou non répondeurs aux traitementsantiviraux. Une étude longitudinale a été réalisée chez des patients non répondeurs ou répondeursdéveloppant une réponse virologique soutenue à une bithérapie standard, interféron pégylé plus ribavirine.L’analyse statistique des résultats a montré que les anticorps anti‐E1E2A,B pouvaient être prédictifs de laréponse au traitement avec une spécificité et une valeur prédictive positive de 100%.La convergence des résultats in vitro et in vivo supporte un rôle neutralisant de l’anticorps monoclonalD32.10, permettant d’envisager son utilisation en immunothérapie.

Hepatitis C Virus (HCV) is the major etiological agent of liver disease in the world with approximately180 million people who are seropositive. The majority (60‐90%) of infected individuals progressesto chronic hepatitis that increases their risk for developing cirrhosis and hepatocellular carcinoma.One of the major limitations of HCV research is the lack of efficient in vitro culture systems andappropriateanimal models. vitro direct cell‐binding assay and an infection system of the human HepaRG cell line were developedby using HCVsp. The HepaRG cells possess potent ability to acquire a mature hepatocyte phenotype.The E1E2‐specific mAb D32.10 was shown to inhibit efficiently and specifically high affinityinteractionsthrough glycosaminoglycans and the CD81 tetraspanin between HCVsp and HepaRGcells with an IC50 = 0.5 μg/ml. This inhibition was more efficient when E1E2‐positive envelopedHCVsp were used selectively for binding studies (IC50 < 0.5 μg/ml). Establishment of infection,replication and propagation of HCVsp were shown to depend on the proliferation/differentiationstage of HepaRG cells. Persistent HCV infection in HepaRG cells could be obtained with production ofE1E2/RNA(+) infectious HCV particles. Preliminary data showed a complete early inhibitory effect ofthe D32.10 mAb on virion RNA production in HepaRG culture supernatants (95% at D14 and 80% atD21 post‐infection).Furthermore, the detection of the anti‐E1E2/D32.10‐binding peptide antibodies during natural HCVinfection demonstrated significant prevalence (90%) of these antibodies: (1) in patients whorecovered spontaneously from HCV infection with high titers compared to patients with chronichepatitis C, and (2) in patients who are complete responders compared to non responders toantivirals. Kinetic analyses revealed that the anti‐E1E2/D32.10‐like humoral response appeared veryearly with high titers (≥ 1/1000) and was associated with complete virus eradication. The positiveand negative predictive values (ROC curve analysis) for achieving or not a sustained viral response toantiviral therapy are 100% and 86%, respectively, reflecting diagnostic accuracy. The anti‐E1E2/D32.10‐binding peptide antibodies may thus predict the outcome of HCV infection andrepresent a new relevant pronostic marker in serum for the HCV diagnosis.Convergence of in vitro and in vivo data strongly support the neutralizing activity of the D32.10 mAb,and thus immunotherapeutic potential of this unique anti‐E1E2 D32.10 mAb.