Modélisation moléculaire et expérimentation en réacteur solide/gaz pour la compréhension de la sélectivité de la lipase B de Candida antarctica

Molecular modeling and experimentation in solid/gas reactor for understanding the selectivity of lipase B from Candida antarctica

• Auteur / Autrice : Zsuzsanna Marton
• Direction : Marianne Graber
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance le 22/07/2010
• Etablissement(s) : La Rochelle
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences pour l'environnement Gay Lussac (La Rochelle ; 2009-2018)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : LIttoral ENvironnement et Sociétés - UMR 7266 / LIENSs
• Jury : Président / Présidente : Sylvain Lamare
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marianne Graber, Sylvain Lamare, Alain Marty, Krystyna Zakrzewska, Gwenaëlle André-Leroux, Huu Vinh Tran
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Alain Marty, Krystyna Zakrzewska

Mots clés

Mots clés contrôlés

Énantiomères

Thermodynamique

Chromatographie en phase gazeuse

Lipases

Mots clés libres

Lipase B de Candida antarctica

Énantiosélectivité

Réacteur solide/gaz

Modélisation moléculaire

Chromatographie gazeuse en phase inverse

Alcoolyse

Activité thermodynamique

Candida antarctica lipase B

Enantioselectivity

Solid/gas reactor

Molecular modeling

Inverse gas chromatography

Alcoholysis

Thermodynamic activity

Résumé

L’objectif de cette thèse était de mieux comprendre les paramètres structuraux et environnementaux gouvernant l’énantiosélectivité de la lipase B de Candida antarctica (CALB), lors de la résolution des alcools secondaires linéaires chiraux. Ces composés sont notamment utilisés comme synthons chiraux dans l’industrie pharmaceutique. Dans un premier temps, une étude systématique des orientations du butan-2-ol et du pentan-2-ol au sein du site actif a été réalisée par modélisation moléculaire. Les résultats suggèrent l’existence de modes d’arrimages supplémentaires à ceux mentionnés dans la littérature. La comparaison selon l’énergie potentielle du substrat des structures les plus stables, combinée à la prise en compte de modes de fixation non productifs, nous a permis d’expliquer qualitativement l’énantiopréférence de la CALB pour la forme R. A l’aide du réacteur solide/gaz, nous avons montré que les résidus hydrophobes formant le canal d’accès du substrat au site actif (Ile189, Leu278 et Ala282), jouaient un rôle significatif dans l’énantiosélectivité de la CALB vis-à-vis des alcools secondaires. L’influence de la partie alkoxy du donneur d’acyle sur le ratio énantiomérique a également pu être mise en évidence. Par ailleurs, nous avons montré que des mutations isostériques de la poche stéréosélective conduisaient à des variations des paramètres thermodynamiques d’activation de l’acylation du pentan-2-ol, probablement suite à des modifications du réseau de liaisons hydrogène formé entre les résidus de la poche. Les études d’adsorption de l'eau et des substrats sur l’enzyme immobilisée nous ont permis de relier l'état d'hydratation de la CALB avec les effets particuliers de l'eau sur l’activité et la sélectivité de l’enzyme.

The aim of this thesis was to understand more precisely the structural and environmental parameters governing the enantioselectivity of lipase B from Candida antarctica (CALB), involved in the discrimination of chiral secondary alcohols enantiomers. These compounds are used in particular for the synthesis of enantiomerically pure pharmaceutical molecules. Initially a systematic study of the orientation of butan-2-ol and pentan-2-ol in the active site was performed by molecular modeling. The results suggest the existence of additional binding modes to those mentioned in the literature. The potential energy comparison of the most stable conformations of the substrate, combined with the existence of non productive binding modes, allowed us to explain qualitatively the enantiopreference of CALB for the R form. Using the solid/gas reactor, we have shown that hydrophobic residues forming the access channel of substrate to the active site (Ile189, Leu278 and Ala282), played a significant role in the enantioselectivity of CALB towards secondary alcohols. The influence of the alkoxy part of the acyl donor on the enatiomeric ratio E has also been highlighted. Furthermore, we showed that isosteric mutations of the stereoselective pocket led to changes in pentan-2-ol activation thermodynamic parameters of acylation, probably due to changes in the hydrogen bonds network formed between residues of the pocket. Studies of water and substrates adsorption on the immobilized enzyme allowed us to relate the hydration status of CALB with specific effects of water on the enzyme activity and selectivity.