Développement de nouveaux supports pour la culture de cellules adhérentes permettant leur détachement sans utilisation de protéases

Development of thermo-responsive supports for the culture of adherent cells and their protease-free detachment

• Auteur / Autrice : Amanda Andriola Silva Brun-Graeppi
• Direction : Otto-Wilhelm Merten
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance le 18/10/2010
• Etablissement(s) : Evry-Val d'Essonne
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole doctorale des Génomes aux organismes (Versailles ; 2000-2015)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité de pharmacologie chimique et génétique et d'imagerie (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Philippe Guégan
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean-Louis Doublier, Guylaine Ducouret
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Dominique Hourdet, Alain Miller

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cultures cellulaires

Protéases

Cellules souches

Mots clés libres

Supports thermosensibles

Xyloglucanes

Résumé

Les cellules adhérentes, dont les cellules souches, sont très prometteuses pour de nombreuses applications dans le domaine des biotechnologies. Toutefois, leur culture représente un défi puisque les méthodes enzymatiques et mécaniques, couramment utilisées pour l’étape de détachement du support de culture, présentent des inconvénients majeurs. Le but de ce travail de thèse a été de développer un support pour la culture de cellules adhérentes permettant leur détachement par modification de la température. Pour cela, nous avons produit des échantillons thermo-associatifs de xyloglucane, un polysaccharide naturel, par réaction avec une enzyme, la ß-galactosidase. Les échantillons obtenus ont été caractérisés par rhéologie, viscosimètrie, diffusion de la lumière et chromatographie par perméation de gel. Nous nous sommes aussi intéressés à l’évaluation de méthodes de stérilisation efficaces capables de préserver les propriétés du polymère. De plus, afin de rendre ce polymère bioadhésif, nous avons étudié son activation et sa fonctionnalisation par un peptide contenant le motif arginine-glycine-aspartate (RGD). Nous avons montré que des cellules modèles A375 surexprimant le récepteur pour le RGD sont capables d’adhérer et de proliférer à 37°C sur des films formés à partir de xyloglucane modifié par du RGD. Leur détachement est possible à température ambiante. L'utilisation de ce nouveau support pour la culture de cellules souches embryonnaires humaines, la production d’un système pour la libération contrôlée de facteurs de croissance ainsi que la conception de billes de taille micrométrique à base de xyloglucane font partie des perspectives de cette thèse.

Adherent cells, including stem cells, hold great promise for many applications in biotechnology. However, cell detachment from standard culture surfaces remains a challenging task since both commonly used enzymatic and mechanical methods have major drawbacks. The aim of my PhD work was to develop a thermoresponsive culture surface supporting cell attachment and survival while enabling a temperature-assisted cell detachment. In order to achieve this goal, thermoresponsive xyloglucan was initially produced by partial galactose removal after reaction with the β-galactosidase enzyme. Samples were characterized by rheology, viscosimetry, light scattering analysis and size-exclusion chromatography. We were also interested in evaluating sterilization methods and their effect on the properties of the polymer. Additionally, in order to obtain a bioadhesive polymer from partially degalactosylated xyloglucan, we studied its functionalization with a peptide containing the arginine-glycine-aspartate (RGD) groupment motif. We have shown that A375 model cells overexpressing the RGD receptor were able to adhere and proliferate at 37 °C on xyloglucan-derived films grafted with RGD and their detachment at room temperature was also demonstrated. The culture of human embryonic stem cells, as well as the introduction of a controlled release system for growth factors and the development of thermoresponsive beads for cell culture comprise the perspectives of this thesis.