Régulation de la télomérase par l'hélicase Pif1 chez la levure Saccharomyces cerevisiae : implication dans la stabilité du génome

Regulation of yeast telomerase by Pif1 : roles in genome stability

• Auteur / Autrice : Manon Bonneton
• Direction : Éric Gilson
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie
• Date : Soutenance en 2010
• Etablissement(s) : Lyon, Ecole normale supérieure
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de biologie et modélisation de la cellule. Lyon (1987-….)

Mots clés

Mots clés contrôlés

ADN -- Réparation

Hélicases

Transférase terminale

Résumé

Les télomères sont les structures nucléoprotéiques qui constituent l'extrémité des chromosomes eucaryotes. L'ADN télomérique est formé par la répétition de courtes séquences, qui ne sont pas répliquées intégralement. A chaque division cellulaire, la taille des télomères diminue donc, jusqu'à atteindre un seuil critique au-delà de laquelle la cellule ne peut plus se diviser. Dans les cellules germinales ou chez les organismes unicellulaires, la taille des télomères reste constante grâce à la présence d'une enzyme, la télomérase. Il s'agit d'une transcriptase inverse, formée d'une sous-unité portant l'activité catalytique (Est2 chez S. Cerevisiae), et d'un ARN (TLC1 chez S. Cerevisiae) qui sert de matrice pour l'ajout des répétitions. La réactivation de la télomérase dans des cellules somatiques peut conduire à leur transformation cancéreuse, car elles acquièrent la capacité de proliférer indéfiniment. A l'inverse, un déficit de l'expression ou de l'activité de la télomérase peut conduire à une autre maladie, la dyskératose congénitale. La compréhension de la régulation de la télomérase est donc importante, notamment dans la recherche sur ces deux pathologies. Chez Saccharomyces cerevisiae, la régulation négative de la télomérase implique notamment Pif1, une hélicase conservée chez l'Homme. Elle inhibe la télomérase en la dissociant de l'ADN télomérique. Nous avons montré que Pif1 et un sous domaine de la télomérase, le domaine des doigts, appartiennent à une même voie de régulation. En utilisant de la télomérase, qui la rend résistante à Pif1 au télomère, et qui permet de détecter une interaction entre Pif1 et le complexe télomérase, nous avons caractérisé cette voie. Ainsi, nous avons montré, d'une part, que le domaine des doigts de la télomérase est impliqué dans le maintien global de la stabilité du génome. En effet, de même que Pif1, il limite l'ajout de télomères sur des cassures double-brin de l'ADN, favorisant ainsi leur réparation par des voies conventionnelles. D'autre part, nous avons décrit l'interaction existant entre Pif1 et le domaine des doigts. Par microscopie, nous avons identifié un complexe au moins partiellement cytoplasmique. Des analyses biochimiques in vivo nous ont permis de conclure que ce complexe est indépendant de l'ADN. Il n'est perdu que lors de mutations de la sous-unité catalytique de la télomérase. Nous pensons que les protéines Pif1 et Est2 interagissent directement l'une avec l'autre. Ces résultats permettent de mieux comprendre la régulation de la télomérase chez S. Cerevisiae, et mettent au jour une implication directe, jusqu'alors inconnue, de la télomérase dans le maintien de l'intégrité du génome.

Most of eukaryotic organisms posses telomeres at the extremity of their linear chromosomes. Telomeres are formed by G-rich repetitive sequences, TG1-3 in Saccharomyces cerevisiae, and of associated proteins. At each stage of replication, telomere length decreases. Telomerase is the reverse transcriptase that is involved in the re-synthesis of telomeres. In S. Cerevisiae, the enzyme is composed of the Est2 protein and of the TLC1 RNA. A few years ago, we described the est2-up34 mutation of the finger domain of Est2, which leads to elongated telomeres. This mutation also makes telomerase resistant to Pif1, a negative regulator of telomerase, which dissociates it from telomeric DNA. Here, we studied more precisely the relationship between Pif1 and telomerase, using the est2-up34 mutation as a tool. First, we analyzed the phenotypes of this mutation at a DSB site. We found that est2-up34 cells are deficient in repair, as GCR rate and sensitivity to genotoxic agents were both increased. The mutated telomerase was more recruited to a lesion, and seems to be insensitive to Rad52 competition. Moreover, est2-up34 mutation is epistatic to RAD24 deletion. We propose that the finger domain is involved in the inhibition of telomerase binding to a DSB, which demonstrate an uncharacterized role in the maintenance of genome stability. Second, we focused on the interaction between Pif1 and telomerase. We found that it exists outside of the nucleus, and is DNA independent. However, the complex formed by Pif1 and telomerase is addressed to DNA after DSB induction, which then could be involved in the regulation of telomerase at a break. Using several gene deletions, we faileds to detect any element required for this interaction. In fact, the complex only depends upon the presence of Est2, suggesting a direct interaction between both proteins. We proposed that Pif1 and the finger domain of telomerase interact to maintain genome stability.