Analyse du polymorphisme associé aux répétitions en tandem pour le typage de deux espèces de mycoplasmes pathogènes chez l’homme : mycoplasma genitalium et Mycoplasma pneumoniae

Analysis of polymorphism associated with tandem repeats for the typing of two human pathogenic mycoplasma species : mycoplasma genitalium and Mycoplasma pneumoniae

• Auteur / Autrice : Charles Cazanave
• Direction : Cécile Bébéar
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences, technologie, santé. Microbiologie
• Date : Soutenance le 27/10/2010
• Etablissement(s) : Bordeaux 2
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Bordeaux)
• Jury : Président / Présidente : Alain Blanchard
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Alain Blanchard, Michel Dupon, François Thiaucourt
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sophie Jarraud, Jean-Louis Koeck

Mots clés

Mots clés contrôlés

Appareil respiratoire -- Infections

Infections sexuellement transmissibles

Mycoplasma pneumoniae

Mycoplasmes

Mots clés libres

Mycoplasma genitalium

Mycoplasma pneumoniae

Typage moléculaire

Mlva

Vih

Mycoplasma genitalium

Mycoplasma pneumoniae

Molecular typing

Mlva

Hiv

Résumé

Au sein des mycoplasmes pathogènes pour l’homme, il existe des mycoplasmes à tropisme respiratoire, parmi lesquels M. pneumoniae, et d’autres dont le tropisme est la sphère urogénitale, comme M. genitalium. M. genitalium est un agent émergent dont l’épidémiologie est encore mal connue. Il est responsable d’infections sexuellement transmissibles, urétrites chez l’homme et cervicites chez la femme. M. pneumoniae est responsable d’infections respiratoires aiguës chez l’enfant et l’adulte jeune. M. genitalium est une espèce extrêmement fastidieuse dont la culture est exceptionnelle à partir de prélèvements de patients. Dans le but d'enrichir notre collection de prélèvements positifs pour M. genitalium un protocole de recherche clinique (FeminIST) proposant un dépistage systématique par PCR du portage de M. genitalium chez les femmes infectées par le VIH de la cohorte Aquitaine a été mis en place. Les méthodes génotypiques ont été largement appliquées pour le typage moléculaire des Mollicutes, mais peu de méthodes simples, automatisées et discriminantes l’ont été à M. genitalium et M. pneumoniae. La MLVA (« Multi-Locus Variable-Number of Tandem-Repeats Analysis ») est une méthode qui analyse le polymorphisme associé aux répétitions en tandem, présentant de nombreux avantages, comme un pouvoir discriminant élevé et la possibilité d’être réalisée directement à partir des prélèvements. Cette technique a été appliquée à M. genitalium et M. pneumoniae et comparée aux méthodes de typage déjà disponibles. Six et cinq VNTR ont été respectivement identifiés comme discriminants pour M. genitalium et M. pneumoniae. Les PCR ont été multiplexées et les amorces marquées pour faciliter et automatiser l’analyse réalisée par électrophorèse capillaire. La méthode a été réalisée sur notre collection de 265 souches cliniques de M. pneumoniae et directement à partir de 123 prélèvements positifs de M. genitalium. La MLVA a permis de typer 89,4 % des prélèvements positifs pour M. genitalium et toutes les souches de M. pneumoniae. Elle s’est révélée plus discriminante que les autres méthodes pour les deux espèces. Les représentations hiérarchiques des résultats confirment l’hétérogénéité de l’espèce M. genitalium et, en revanche, l’homogénéité de l’espèce M. pneumoniae. En résumé, la MLVA s’avère être un outil de typage moléculaire performant pour M. genitalium et M. pneumoniae donnant des résultats facilement échangeables entre laboratoires.

Human pathogenic mycoplasmas include respiratory tract species, such as M. pneumoniae and urogenital species, such as M. genitalium. M. genitalium is an emerging agent for which epidemiology is unclear. It is involved in sexually transmitted infections, mainly urethritis in men and cervicitis in women. M. pneumoniae is responsible for acute respiratory infections especially in children. M. genitalium is a fastidious species for which culture remains extremely difficult. In order to extend our collection of samples positive for M. genitalium, a clinical research study (FeminIST) was conducted. It consisted in a PCR screening for M. genitalium in the urogenital tract of HIV-infected women of the Aquitaine cohort. Genotyping methods have been widely applied to Mollicutes, but few simple and automatized methods have been developed for M. genitalium and M. pneumoniae. The MLVA (Multi-Locus Variable-Number Tandem-Repeats Analysis) method analyzes the genome polymorphism associated with tandem repeats. Its advantages are a high discriminatory power and the possibility of being used directly from clinical samples. This technique was applied to M. genitalium and M. pneumoniae and compared with other available genotyping methods. Six and five VNTR were selected for M. genitalium and M. pneumoniae, respectively. The use of multiplex PCR and capillary electrophoresis enabled a high-throughput analysis and allowed an easy interpretation of the results. The method was applied to our collection of 265 M. pneumoniae clinical strains and used directly from 123 clinical samples positive for M. genitalium. 89.4% of M. genitalium PCR-positive samples and all the M. pneumoniae isolates were amplified and typed. We showed a higher discriminatory power for our MLVA than for other genotyping methods, without the need of a fastidious sequencing step. The hierarchical representation of results confirms the M. genitalium species heterogeneity and the M. pneumoniae species homogeneity. MLVA appears to be a good tool for molecular typing of these two mycoplasma species, allowing an easy exchange of data between laboratories.