Universalité des méthodologies protéomiques pour l'identification et la caractérisation des protéines

Universality of proteomics methodologies for protein identification and characterization

• Auteur / Autrice : Laetitia Fouillen
• Direction : Alain Van Dorsselaer
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Strasbourg

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines -- Analyse

Méthodologie

Protéomique

Protéines -- Modifications posttraductionnelles

Chromatographie en phase liquide

Spectrométrie de masse

Résumé

La grande diversité des problèmes biologiques abordés ces dernières années par l’analyse protéomique a montré que celle-ci devait être encore développée en fonction du type de question posée mais aussi en fonction des contraintes techniques imposées par les échantillons. Les méthodologies protéomiques sont composées de plusieurs étapes mettant en jeu la préparation d'échantillon, la séparation des protéines et peptides et enfin l'analyse des protéines et peptides par spectrométrie de masse suivie de l'interprétation des données générées. Les études présentées ont nécessité d'adapter ces différentes étapes pour répondre au mieux aux diverses questions biologiques abordés au cours de cette thèse : L'identification des protéines impliquées dans des complexes protéine/protéine et ARN/protéine : une stratégie protéomique impliquant une purification du complexe d'intérêt et des analyses par nanoLC-MS/MS a pu être développée. La caractérisation fine des protéines phosphorylées purifiées : une méthodologie adaptée, en deux étapes, a été mise en place pour la détermination de l'état de phosphorylation des protéines entières et la localisation des sites exacts de phosphorylation sur le squelette peptidique. L'identification et la quantification relative des protéines plasmatiques exprimées chez le manchot Adélie lors du jeûne prolongé à l'aide d'une stratégie de quantification par analyse d'image et d'une stratégie d'identification par des approches d'interprétation des données MS/MS. Ces travaux de thèse montrent l’universalité des approches protéomiques, qui devront toujours être adaptées très finement pour garder leur potentiel pour l’analyse d’échantillons provenant d’origines diverses et de complexités variables.

The high diversity of biological questions treated by proteomics shows that adaptation of proteomic strategies is needed to answer each specific question and cope with technical constraints imposed by biological samples. Proteomic methodologies consist in several steps, as sample preparation, proteins and peptides separation and finally proteins and peptides analyses by mass spectrometry followed by interpretation of generated data. The different steps were needed to be adapted to answer at most to the numerous biological questions, which are explored in this PhD thesis: Identification of proteins involved in protein/protein and RNA/protein complexes: a proteomic strategy involving the purification of complex of interest and nanoLC-MS/MS analyses has been developed. Characterization of phosphorylated protein: a two-step adapted methodology has been developed to determine entire protein phosphorylation state and phosphorylation sites localization. Identification and relative quantification of plasmatic proteins expressed during the prolonged fasting of Adélie penguin with a double strategy of quantification by image analyses and identification by MS/MS data interpretation approach. Those PhD studies show the universality of proteomic methodologies, which needed to be cleverly adapt to prove their potentiality in analyses of samples coming from diverse origins and showing different complexities.