Suivi intracellulaire de l'oligomérisation de la protéine virale de régulation (VPR) au cours du processus d'assemblage du virus d'immunodéficience humaine de type (VIH-1)

Study of the oligomerization properties of the viral protein R (Vpr) in a cellular environment during HIV-1 virus assembly

• Auteur / Autrice : Joëlle Véronique Fritz
• Direction : Hugues de Rocquigny
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Strasbourg

Mots clés

Mots clés contrôlés

Virus à ARN

Oligomères

VIH (Virus de l'Immunodéficience Humaine)

Résumé

L’assemblage des particules virales du virus VIH-1 est essentiellement gouverné par la polyprotéine Pr55Gag. Celle-ci possède dans sa partie C-terminale le domaine p6 qui permet l’encapsidation dans les particules de la protéine auxiliaire Vpr. Vpr est composée de 96 acides aminés et possède plusieurs fonctions lors du cycle réplicatif. En effet, elle interagit avec de nombreuses protéines cellulaires dont les conséquences sont l’arrêt des cellules en phase G2, l’apoptose et la translocation du complexe de pré-intégration (ADN proviral) dans le noyau des cellules quiescentes. Sa structure obtenue par RMN est composée de trois hélices a orientées de façon à former un plateau hydrophobe central. Par ailleurs des études biochimiques ont montré la propension de cette protéine à former des oligomères. Les travaux de thèse ont portés essentiellement sur les propriétés d’oligomérisation de Vpr en milieu cellulaire et au rôle de celle-ci lors de l’interaction entre Vpr et la polyprotéine Pr55Gag. Pour cela nous avons cloné nos protéines avec des marqueurs fluorescents (eGFP/mCherry) ou des séquences liant des chromophores ReAsH et FlAsH (reconnaissant un motif TC). L’expression de ces protéines a ensuite était suivie par microscopie confocale ou par imagerie en temps de vie (FLIM). Nos études démontrent que Vpr s’oligomérise en milieu cellulaire sous forme de dimère-trimère qui se localisent notamment au niveau de l’enveloppe nucléaire. Cette oligomérisation nécessite le coeur hydrophobe central, car des mutations ponctuelles le perturbant se traduisent par l’expression de protéines monomériques diffusant dans la cellule. Nous avons pu obtenir des images du complexe Pr55Gag-Vpr et confirmé l’importance des deux motifs 15FXFG18 et 41LXXLF45, dans la formation du complexe. De manière intéressante, nous montrons que l’oligomérisation de Vpr est indispensable à sa reconnaissance par Pr55Gag. Inversement des protéines Pr55Gag présentant des défauts d’assemblage conservent leur propriété d’interagir avec Vpr. De plus, nos images montrent qu’en présence de Pr55Gag, Vpr est accumulée au niveau de la membrane plasmique, lieu d’assemblage des particules virales. Des mutants ponctuels de Pr55Gag qui diffusent dans le cytoplasme ou au contraire sont présents dans des vésicules de type MVB de la cellule hôte imposent leur localisation à Vpr suggérant que c’est la protéine Pr55Gag qui dirige entièrement la localisation cellulaire de la protéine accessoire.

During HIV-1 assembly, the viral protein R (Vpr) is incorporated into newly formed viral particles via an interaction with the C-terminal domain of the Gag polyprotein precursor Pr55Gag. Vpr has been implicated in the nuclear import of the viral DNA and subsequently in its transcription. In addition, Vpr can impact on the cell physiology by causing G2/M arrest and apoptosis. The 3D structure of Vpr was solved by NMR and is composed of three amphipathic α helices spanning residues surrounded by flexible N- and Cterminal sequences. Two loops spanning residues allow a mutual orientation of these helices, conferring a globular conformation to the protein and promoting the formation of a hydrophobic core with numerous hydrophobic amino acids scattered throughout Vpr. The goal of this PhD work was focused on the oligomerization properties of Vpr in a cellular environment and to establish the function of this oligomerization in the interaction between Vpr and Pr55Gag during HIV-1 assembly. To address this issue, HeLa cells were transfected with plasmids expressing eGFP- and mCherry-tagged Vpr and Pr55Gag-TC, the latter being visualized by biarsenical labeling reagents (FlAsH/ReAsH). These cells were studied by confocal microscopy, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) and fluorescence correlation spectroscopy (FCS). Our results show that Vpr-Vpr interactions take place mostly at or close to the nuclear envelope. This oligomerization and localization require Vpr’s central hydrophobic core. Indeed, point mutations disrupting that core drastically impaired both Vpr-Vpr interactions and Vpr specific localization at the nuclear rim. We further evidence that the Pr55Gag-Vpr complexes, imaged in cellulo, mainly accumulated at the plasma membrane and confirmed the importance of the two Pr55Gag(p6) motifs, 15FXFG18 and 41LXXLF45, for Pr55Gag-Vpr complex formation. We also report that Vpr oligomerization is crucial for Pr55Gag recognition. On the other hand, Pr55Gag-Vpr complexes are still formed when Pr55Gag bears mutations causing a defect in its multimerization. Moreover, when Vpr was co-expressed with Pr55Gag mutants diffusing inside the cytoplasm or present on the contrary in multivesicular structures, Vpr lost its specific location on the plasma membrane and was detected in the same cellular compartments as the Pr55Gag mutants. These findings suggest that Pr55Gag-Vpr recognition is most probably occurring already at their respective site of synthesis and thus seems to be an early step in Pr55Gag assembly.