Biocapteur associant l’acétylcholinestérase et la phosphotriesterase pour un contrôle environnemental des insecticides organophosphorés

par Georges Istamboulié

Thèse de doctorat en Sciences de l'ingénieur

Sous la direction de Thierry Noguer.

Soutenue en 2009

à Perpignan , dans le cadre de École doctorale Énergie environnement (Perpignan) .

mots clés

• Acétylcholinestérase
• Pesticides -- Toxicologie
• Phosphore -- Composés organiques
• Polluants de l'eau
• Phosphoric triester hydrolases

Résumé

Ce travail de thèse présente la mise au point de biocapteurs enzymatiques pour une détection sensible et sélective de deux insecticides organophosphorés (OPs) considérés par la Communauté Européenne comme des polluants prioritaires pour les eaux de surface : le chlorpyriphos (CPO) et le chlorfenvinphos (CFV) (directive EC 2455/2001/E). La très haute sensibilité des capteurs a été obtenue en combinant l’utilisation d’une acétylcholinestérase (AChE) modifiée génétiquement (MG) avec une méthode d’immobilisation orientée par affinité His-Ni sur des billes magnétiques. La sélectivité du système a été obtenue en utilisant la phosphotriestérase (PTE), une enzyme isolée à partir de Pseudomonas diminuta, qui est capable d’hydrolyser certains OPs. Un capteur bienzymatique associant l’AChE à la PTE a permis une détection sélective du CPO et du CFV en solutions simples. L’analyse de mélanges des deux OPs a été rendue possible par l’utilisation d’un réseau neuronal intégrant trois capteurs dont deux mono-enzymatiques (AChE sauvage ou MG) et un bi-enzymatique (AChE-MG + PTE). Ce système a permis une détection spécifique des deux OPs pour une large zone de concentrations. Une étude complémentaire a montré que l’immobilisation de la PTE sur une colonne intégrée dans un système en flux peut constituer un outil efficace pour la détoxification d’eaux de surface contaminées par les deux OPs étudiés. Enfin, la dernière partie de la thèse a été consacrée à l’étude d’un nouveau médiateur permettant l’oxydation de la thiocholine à 100 mV vs Ag/AgCl : le PEDOT:PSS.

Titre traduit

Biosensor associating acetylcholinesterase and phosphotriesterase for environmental monitoring of organophosphorus insecticides

Résumé

This work presents the development of enzymatic sensors for the sensitive and selective determination of two organophosphate (OPs) insecticides pointed out by European Community as priority pollutants of surface waters: chlorpyriphos (CPO) and chlorfenvinphos (CFV) (directive EC 2455/2001/E). The very high sensitivity of the sensors has been achieved by combining the use of a genetically-modified (GM) acetylcholinesterase (AChE) with an oriented immobilisation method based on His-Ni affinity on magnetic beads. The selectivity of the system has been obtained by using phosphotriestérase (PTE), an enzyme isolated from Pseudomonas diminuta, which has the capability of hydrolysing certain OPs. A bi-enzymatic sensor associating AChE and PTE has allowed the selective detection of CPO and CFV in simple solutions. The analysis of OPs mixtures has been then performed by using an artificial neural network incorporating three sensors, two mono-enzymatic (wild AChE or GM-AChE) and one bi-enzymatic (GM-AChE + PTE). This system has allowed the specific detection of the two OPs in a wide range of concentrations. A complementary study has shown that immobilizing PTE into a column integrated in a flow system allows the detoxification of surface waters contaminated by the two studied OPs. Finally, the last part of this work has been devoted to the study of a new potential mediator for thiocholine oxidation : PEDOT-PSS.