Targeted mutations in Trametes vesicolor laccase : reactivity aspects

par Raffaela Vadalà

Thèse de doctorat en Chimie moléculaireChimie moléculaire

Sous la direction de Claude Jolivalt et de Carlo Galli.

Soutenue en 2009

à Paris 6 en cotutelle avec l'Università degli Studi di Roma"La Sapienza" .

  • Titre traduit

    Mutagénèse site-dirigée dans la Laccase du Trametes versicolor et étude de la réactivité


  • Résumé

    Les Laccases sont des enzymes appartenant à la famille des oxydases multi-cuivre que l'on trouve dans de nombreuses plantes et champignons. Elles catalysent l'oxydation à un électron de substrats aromatiques riches en électrons (phénols ou amines), couplée à la réduction à quatre électrons du dioxygène en eau. Des mutations ponctuelles de la laccase du champignon Trametes versicolor nous ont permis, d'une part, d'acquérir de nouvelles informations sur les interactions entre le substrat et le site actif de l’enzyme et, d'autre part, d’oxyder un plus large spectre de composés. Notre étude montre que l'efficacité d'oxydation de la laccase ne dépend pas uniquement du potentiel d'oxydo-réduction du substrat. Elle dépend aussi de la facilité d'approche du substrat de l'His458 qui transfère ensuite les électrons au site Cu(T1). L'utilisation de la mutagenèse dirigée pour remplacer l'unique résidu polaire du site actif de la laccase, un acide aspartique en position 206, ainsi que la détermination de la réactivité d'une série homologue de phénols para susbtitués à deux valeurs de pH ont apporté des éléments expérimentaux sans ambiguïté quant à la stabilisation électrostatique impliquant ce résidu anionique (Asp206). Un autre type de mutation a concerné une série de phénylalanines qui limite l’accessibilité de la poche catalytique. Plusieurs résidus phénylalanines ont été mutés en résidus alanine plus petits, soit successivement, soit par couple. Nous nous attendions à une augmentation de l'efficacité de l'oxydation des substrats encombrants. Malheureusement les mutants n'ont pas tous montré une réactivité supérieure à celle de l'enzyme non mutée envers la série choisie de phénols


  • Résumé

    Laccases are a family of multi-copper oxidases, found in many plants and fungi. They catalyse single electron oxidation of electron-rich aromatic substrates, usually phenols or amines, coupled to the four-electron reduction of dioxygen to water. Single-point mutations in Trametes versicolor Laccase have enabled us to acquire novel information about the profitable interactions of the substrate in the enzymatic pocket and to design and express mutated enzymes hopefully apt to oxidize a larger spectrum of substrates. Our study shows that the oxidation efficiency of laccase does not uniquely respond to the redox potential of a putative substrate. It also reflects the ease of approach of the substrate to T1 Cu through its His458 electron relay. The use of site-directed mutagenesis to replace the unique polar residue in laccase active site (Asp206) with Glu, Ala and Asn residues, along with the determination of the enzymatic reactivity at two different pH values, has given unambiguous experimental support to the electrostatic stabilization brought about by this anionic 206-residue. The use of an homologous series of X-substituted phenols has enabled us to shed light on this facet of the oxidation reactivity. The other mutation concerned a series of phenylalanines which confers size-discriminating ability to the enzyme. Upon mutating these phenylalanine residues in single and double mutations with smaller alanine residues we expected an increase in the oxidation efficiency of the mutants towards bulky substrates. Unfortunately not all the Phe mutants turned out to be more reactive than the non-mutated TvL towards a series of model phenols endowed with increasing size.

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  • Annexes : Bibliogr. en fin de chapitres. 72 réf. bibliogr.

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  • Cote : T Paris 6 2009 571

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  • Cote : 2009PA066571
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