Mise au point d’un milieu pour la cryopréservation de la semence équine et mécanismes de cryoprotection impliqués

Development of a new extender for cryopreservation of stallion semen and mechanisms of cryoprotection involved

• Auteur / Autrice : Elodie Pillet
• Direction : Michèle Magistrini
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie. Biologie cellulaire
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Rennes, Agrocampus Ouest

Mots clés

Mots clés contrôlés

Insémination artificielle

Étalons

Résumé

Pour la réussite de l’insémination artificielle de semence congelée, la composition du milieu de congélation est un facteur clef. Les objectifs de la thèse ont été 1) de mettre au point un milieu pour congeler la semence équine, qui soit prêt à l’emploi et de composition optimisée ; 2) d’acquérir des connaissances en cryobiologie des gamètes. Nous avons démontré que le pouvoir cryoprotecteur d’un milieu à base de phosphocaséinate natif (l’INRA96®) supplémenté de 2% de jaune d’oeuf (JO) et de 2. 5% de glycérol, était significativement supérieur à celui du milieu habituel, à base de lait et JO (71% de fertilité/cycle versus 40%, p<0. 01, n=84cycles). Les paramètres de qualité des spermatozoïdes à la décongélation, évalués par analyse d’images, spectrofluorimétrie et cytométrie en flux, ont toutefois clairement montré la difficulté à évaluer in vitro le pouvoir fécondant des spermatozoïdes in vivo. Nous avons ensuite démontré que le pouvoir cryoprotecteur de la fraction plasma de JO stérilisée était équivalent à celui du JO entier (69% de fertilité/cycle versus 60%, p>0. 05, n=70cycles). L’ensemble de ces résultats a permis la mise au point d’un milieu de formulation standardisée (brevet FR2925917), stérile et commercialisable prêt à l’emploi (INRAFreeze ®, IMV-Technologies). Dans le but d’optimiser le milieu et d’identifier précisément les molécules impliquées dans la cryoprotection, la démarche de fractionnement du JO a été poursuivie. Suite à des analyses in vitro, nous avons testé in vivo le pouvoir cryoprotecteur de liposomes de phospholipides composés essentiellement de phosphatidylcholine et de phosphatidyléthanolamine de JO. Les résultats encourageants obtenus (55% de fertilité/cycle avec les liposomes versus 68% avec le JO, p>0. 05, n=80cycles) restent à améliorer, notamment en augmentant le degré d’insaturation des acides gras des phospholipides des liposomes.

For the success of artificial insemination of frozen semen, the composition of the freezing extender is a key factor. The objectives of the thesis were 1) to develop an extender to freeze stallion semen, ready to use and of optimized composition; 2) to acquire knowledge in gametes’ cryobiology. We showed that the cryoprotective ability of an extender based on native phosphocaseinate (INRA96®) supplemented with 2% egg yolk (EY) and 2. 5% glycerol was significantly higher than the usual extender based on milk and EY (fertility/cycle of 71% versus 40%, p<0. 01, n=84cycles). However post-thaw quality parameters of spermatozoa analysed by imaging analyses, spectrofluorimetry and flow cytometry clearly emphazised the difficulty to assess in vitro the fertility potential of spermatozoa in vivo. We showed then that the cryoprotective ability of the sterilized plasma fraction of EY was similar whole EY (fertility/cycle of 69% versus 60%, p>0. 05, n=70cycles). These whole results permitted the development of an extender of standardized composition (patent FR2925917), sterile and marketable in a ready to use form (INRA-Freeze®, IMV-Technologies). In order to optimize the extender and to precisely identify the molecules implicated in the cryoprotection, the EY ,cryoprotectives ability of phospholipids liposomes mainly composed of EY phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine. The promising results we got (fertility/cycle of 55% with liposomes versus 68% with EY, p>0. 05, n=80cycles) remain to be improved, in particular by increasing the insaturation degree of the phospholipids’ fatty acids of liposomes.