Peptide aptamers : tools for the analysis of RAS signaling

par Yindi Ding

Thèse de doctorat en Science de la vie

Sous la direction de Brian B. Rudkin et de Chong-Guang Yuan.

Soutenue en 2009

à Lyon, École normale supérieure (sciences) , en partenariat avec Laboratoire de Biologie moléculaire, intégrée et cognitive (laboratoire) .


  • Résumé

    Cette thèse décrit l'utilisation d'aptamères peptidiques (PA) comme outil d'étude de la signalisation de Ras dans des modèles de lignées cellulaires. Elle décrit ensuite les analyses initiales de l'effet biologique de petites molécules sélectionnées pour leur capacité à inhiber l'interaction entre PAs et H-RasV12. Finalement elle présente la caractérisation de précurseurs de neurones de DRG et que nous espérons pouvoir utiliser pour de futures études. Afin d'analyser les interactions entre Ras et différentes protéines et les perturbations de la voie de signalisation, PAs dirigés contre la protéine Ras sauvage et Ras oncogène avaient été sélectionnés. PA 105R présente un phénotype d'interaction en double hybride de levure (Y2H) avec H-, K-, et N-Ras. PA HR3C présente un phénotype d'interaction avec la protéine Ras sauvage et H-RasV12. Dans les cellules PC12, HR3C bloque aussi bien la signalisation de Ras sauvage que celle de H-Ras oncogène. Par contre dans les cellules AsPC1, la protéine oncogène K-RasD12 endogène est inhibée par 105R, alors que HR3C est bien moins efficace. Des mutations dirigées contre les acides aminés localisés à la surface de HrasV12, suivi d'un test d'interaction en Y2H, ont permis de cartographier les sites de liaison des PAs biologiquement actifs sur H-RasV12. L'activité biologique d'un certain nombre de petites molécules sélectionnées pour leur capacité à dissocier l'un des PAs spécifique de Ras. Ces études ont abouti à l'identification d’une molécules qui pourrait être biologiquement pertinente. Des études supplémentaires seront requises afin d'obtenir, à partir de ces molécules, de possibles candidats aux études pré-cliniques. Finalement, nous avons mis en place la technologie des PAs pour une utilisation dans des cellules primaires dérivées rat DRG, et développé une lignée précurseur de cellules neuronales de DRG que nous avons maintenue en culture 2 ans. Nous espérons ainsi utiliser ces précurseurs pour des études futures dans le PNS,


  • Résumé

    This thesis describes the use of peptide aptamers (PA) for the study of Ras signaling in model cell lines. It further describes the initial analysis of biological effects of small molecules identified for their capacity to displace a biologicallyactive PA from H-RasV12. Finally, it offers characterization of DRGn precursors that we hope to be able to use for future studies. To analyze Ras interactions with other proteins and perturbation of signaling pathways, PAs directed towards wt Ras and oncogenic Ras had been selected. PA 105R elicited an interaction phenotype in yeast two–hybrid (Y2H) with H-, K-, and N-Ras. PA HR3C gave an interaction phenotype with H-Ras wt and HrasV12. In PC12 cells, it blocked both wt and oncogenic H-Ras signaling, whereas 105R had little effect on NGF-induced signaling, but inhibited that stimulated by oncogenic Ras. In contrast, in AsPC-1, endogenous oncogenic K-RasD12 is inhibited by 105R, while HR3C is much less effective. Targeted mutation of amino acids located on the surface of H-RasV12, followed by Y2H interaction mating assays, offered the possibility to map the binding sites of the biologically-active Pas. We evaluated biological activity of a number of small molecules selected for their capacity to displace one of the Ras-specific PAs from the target. These studies resulted in the identification of one molecule that may be biologically pertinent. Further studies will be required to develop possible pre-clinical candidates based on these molecules. Finally, we were to implement the PA technology in primary cells derived from rat DRG, and we developed a DRG precursor line that we have maintained in culture for over two years. It is hoped that we use thes precursors for future studies in the PNS.

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  • Détails : 1 vol. (121 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 111-121

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