Caractérisation des ADN polymérases de Pyrococcus abyssi en présence de matrices ADN endommagées

Characterisation of the DNA polymerases from Pyrococcus abyssi in the presence of damaged DNA

• Auteur / Autrice : Adeline Palud
• Direction : Jean-Paul Raffin, Ghislaine Henneke
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie. Microbiologie
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Brest

Mots clés

Mots clés contrôlés

ADN polymérases

ADN -- Altération

Archéobactéries

Mots clés libres

ADN polymérases

Site AP

Translésion

Détection de lésions

Archaea

Lésions oxydatives

PCR ADN endommagés

Bioréacteur gas-lift

Résumé

Les archaea hyperthermophiles colonisent des biotopes où sévissent des conditions extrêmes de température, de pH, des radiations ionisantes, propices à l’apparition de lésions dans l’ADN. L’euryarchaea hyperthermophile Pyrococcus abyssi (Pab) a été utilisée ici comme modèle pour étudier l’impact de ces lésions sur la maintenance génomique. La lére partie, consacrée à la détection des lésions dans le génome de Pab, a montré pour la 1ère fois que Pab possède un taux plus élevé de sites AP et de lésions 8-oxo-dG que E. Coli. Suite à un stress oxydatif en bioréacteur gas-lift, l’augmentation du taux de 8-oxo-dG observée est corrélée à une diminution importante de la survie cellulaire, soulignant l’effet génotoxique du stress chez Pab. Le 2nd objectif a été d’élucider le comportement des ADN polymérases réplicatives de Pab, PabpolB (Famille B) et PabpolD (Famille D), en présence d’ADN endommagé. Bien qu’elles réussissent à franchir les lésions 8-oxo-dG et 8-oxo-dA, elles sont bloquées par un site AP. L’étude des paramètres cinétiques d’incorporation a démontré la haute fidélité des Pabpols en présence d’ADN non endommagé. Néanmoins, elles sont sensibles à la présence d’un site AF et favorisent l’incorporation d’un dAMP face à ce dommage. Leur fonction exonucléasique joue alors un rôle important dans la protection contre la mutagénèse en agissant comme une barrière cinétique à l’incorporation. L’insertion du dAMP est aussi privilégiée en face de la lésion 8-oxo-dG par les 2 Pabpols. Face à la lésion 8-oxo-dA, seule PabpolD incorpore majoritairement un dAMP et un dTMP. La 3ème partie biotechnologique a souligné la capacité des Pabpols à amplifier de l’ADN endommagé par PCR.

Hyperthermophilic archaea cope with harsh conditions such as high temperatures, pH shifts and ionising radiations. Such environments favour the apparition of DNA lesions, Here, Pyrococcus abyssi (Pab) was used as an attractive model to analyse the impact of DNA lesions onto the maintenance of genome integrity. The 1st part aimed at detecting DNA damages in the genome of Pab and showed that endogenous AP sites and the oxidized DNA base 8-oxo-dG persist at a higher level in Pab genome compared with E. Coli. Under oxydative stress conditions performed in a gas-lift bioreactor, the 8-oxo-dG increasing rate is correlated to the important cell survival diminution, assessing the genotoxic effects of this stress on Pab. The 2nd objective was to unravel the behaviour of the replicative DNA polymerases from Pab, PabpolB (Familly B) and PabpolD (Familly D). In presence of damaged DNA. Both Pabpols are able to bypass 8- oxo-dG and 8-oxo-dA whereas they are blocked by the AP site. Steady-state kinetics reinforced that Pabpols are high-fidelity DNA polymerases onto undamaged DNA. Moreover, Pabpols preferentially inserted dAMP opposite an AP site albeit inefficiently. Their exonuclease function seemed to endow with an important role in the protection against mutagenesis since it acts as a kinetic barrier, preventing misincorporation. The incorporation of the dAMP is also favoured in front of 8-oxo-dG by both Pabpols. However, only Pabpol inserts a dAMP or a dTMP opposite 8-oxo-dA. The biotechnological 3rd part showed that both Pabpols are able to amplify damaged DNA by PCR.