Study of the molecular mecanism of genome packaging of the bacteriophage SPP1, a double strain DNA virus

Etude du mécanisme moléculaire d'encapsidation du génome du bactériophage SPP1, un virus à ADN double brin

• Auteur / Autrice : Ana Cuervo
• Direction : Leonor Oliveira, Paulo Tavares
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques. Ingénierie des protéines
• Date : Soutenance en 2008
• Etablissement(s) : Paris 11
• Partenaire(s) de recherche : autre partenaire : Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Translocation (génétique)

Bactériophages

Mots clés libres

Moteur moléculaire

Protéine portale

Assemblage viral

Empaquetage viral

Résumé

L’empaquetage de l’ADN viral à l'intérieur de procapsides préformées est une stratégie permettant la protection du génome. Cette tâche est accomplie par un moteur moléculaire assemblé dans un sommet spécialisé de la procapside. Ce complexe, composé de l'ATPase virale et de la protéine portale, transloque le génome en utilisant l'énergie de l'ATP. La protéine portale présente un pore central servant au passage de l'ADN. Une question majeure pour comprendre le mécanisme d'encapsidation consiste à savoir si la protéine portale est un simple conduit pour l’ADN ou si elle participe de façon active lors de ce processus. Afin de vérifier si un changement conformationnel de cette protéine est essentiel pour permettre l'encapsidation de l'ADN, nous avons inséré des doubles mutations en cystéine qui pourraient immobiliser certains éléments structuraux de façon covalente. Nous avons utilisé comme modèle d’étude gp6, la protéine portale du bactériophage SPP1. L'analyse fonctionnelle des protéines mutantes générées nous a permis de sélectionner un candidat dont l'activé biologique n'était pas affectée par l'insertion des résidus cystéine. Nous avons montré que ce mutant bloque l'encapsidation de l'ADN lorsque les ponts disulfure sont formés. La réduction des liaisons covalentes restaure l'efficacité normale d'encapsidation de l'ADN, suggérant fortement que la mobilité des éléments structuraux liés covalemment est essentielle lors du processus de translocation. Ce travail a ainsi démontré pour la première fois que la protéine portale subit un changement conformationnel lors de l’empaquetage du génome viral.

Transport of DNA into preformed procapsids is a general strategy for genome protection inside viral particles. In most viruses, this task is accomplished by a complex of the viral packaging ATPase with the portal protein, assembled at a specialized vertex of the procapsid. This molecular motor translocates DNA through the central tunnel of the portal protein. A central question to understand the packaging mechanism is whether the portal is a mere conduit for DNA or if it participates actively on DNA translocation. In order to investigate whether portal protein structural rearrangements are essential for DNA translocation, we engineered cysteine mutants that could covalently immobilize specific structural elements. Gp6, the SPP1 bacteriophage portal protein, was used as a model during this study. The functional analysis of generated mutant proteins lead us to select one candidate whose biological activity was not affected by the insertion of the cysteine residues. This mutant blocked DNA packaging when disulfide bridges were formed. Reduction of covalent links restored normal packaging efficiency, suggesting that mobility of the linked structural elements is essential during DNA translocation process. Altogether these results demonstrate for the first time that conformational changes in portal protein are required during DNA packaging.