Analysis of the function of protein kinase A and ubiquitin protease USP8 in the Drosophila circadian clock

• Auteur / Autrice : Ruohan Xia
• Direction : François Rouyer
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques. Génétique
• Date : Soutenance en 2008
• Etablissement(s) : Paris 11
• Partenaire(s) de recherche : autre partenaire : Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines kinases

Drosophiles

Mots clés libres

Rythmes veille-sommeil

Pigment-dispersing factor

Résumé

La drosophile horloge circadienne des boucles transcriptionnelle et post-traductionnelles des mécanismes qui génèrent chaque jour des oscillations de la protéines PERIOD (PER) et TIMELESS (TIM). Mon premier projet vise à comprendre la fonction circadien de la PKA dans Drosophila horloge circadienne. Des mutants du gène codant pour la sous-unité catalytique de l'cAMP-dépendante protein kinase A (PKA) ont été présentés pour afficher modifié le comportement des rythmes d'horloge normale, mais les oscillations des protéines en tête des extraits, ce qui suggère que les actes PKA en aval du mécanisme d'horloge de base. Nous avons exprimé une PKA dominante négative sous-unité de réglementation au principal horloge neurones qui contrôlent les rythmes d'activité en constante ténèbres (la partie ventrale latérale neurones (LNV) qui exprime la pigment-dispersing factor, PDF), et dans les yeux photorécepteurs. Nous montrons que la diminution de l'activité PKA dans les neurones horloge conduit à arrhythmicity de comportement, ce qui indique que l'activité PKA est nécessaire au sein de l'horloge neurones. En outre, PKA arrêts par l'inhibition et de protéines TIM oscillations dans le PDF-LNV positif mais ne semble pas les toucher dans les autres neurones d'horloge ou dans l'enceinte des yeux. Nos résultats indiquent que PKA joue un rôle majeur dans le contrôle de l'horloge protéines oscillations au principal stimulateur cardiaque neurones, le PDF exprimant LNV. Cela suggère donc que l'horloge mécanismes varient selon les neurones de la sous-Drosophila circadien réseau. Mon deuxième projet vise à caractériser la fonction putative circadien de la CG5798 gène qui code une protéine qui putatif est similaire à celle des mammifères ubiquitine-spécifique protéase USP8. CG5798 (dUsp8) transcriptions niveaux sont avérés circadien réglementée dans la drosophile tête. Utilisation dUSP8 anti-anticorps, nous montrons que dUSP8 taux de protéines faiblement oscillent à des niveaux plus élevés pendant la nuit. Mouches transgéniques ont été produites pour objectif de la surexpression (dUSP8 ADNc) ou démontable (dUSP8 ARNi) du gène dans les neurones d'horloge. Mouches exprimant ces transgènes dans tous les neurones horloge font apparaître l'activité locomotrice des défauts, mais ciblée dUSP8 expression de l'ARNi dans le PDF exprimant LNV ne porte pas atteinte à la rythmicité du comportement, ni PER oscillations dans la LNV. Cela donne à penser que USP8 est impliqué dans d'autres horloge neurones (cellules).

The Drosophila circadian clock involves transcriptional loops and post-translational mechanisms that generate daily oscillations of the PERIOD (PER) and TIMELESS (TIM) proteins. My first project aims at understanding the circadian function of PKA in the Drosophila circadian clock. Mutants of the gene encoding the catalytic subunit of the cAMP-dependent protein kinase A (PKA) were shown to display altered behavioral rhythms but normal clock proteins oscillations in head extracts, suggesting that PKA acts downstream of the core clock mechanism. We have expressed a PKA dominant negative regulatory subunit in the main clock neurons that control activity rhythms in constant darkness (the ventral lateral neurons (LNv) that express the pigment-dispersing factor, PDF), and in the eye photoreceptors. We show that decreased PKA activity in the clock neurons leads to behavioral arrhythmicity, thus indicating that PKA activity is required within the clock neurons. Furthermore, PKA inhibition stops PER and TIM protein oscillations in the PDF-positive LNv but does not appear to affect them in the other clock neurons or in the compound eye. Our results indicate that PKA plays a major role in the control of clock protein oscillations in the main pacemaker neurons, the PDF-expressing LNv. This therefore suggests that clock mechanisms vary among the neuronal subsets of the Drosophila circadian network. My second project aims at characterizing the putative circadian function of the CG5798 gene, which encodes a putative protein that is similar to the mammalian ubiquitin-specific protease USP8. CG5798 (dUsp8) transcripts levels were shown to be circadian regulated in the drosophila head. Using anti-dUSP8 antibodies, we show that dUSP8 protein levels weakly oscillate with higher levels at night. Transgenic flies have been generated to target overexpression (dUSP8 cDNA) or knockdown (dUSP8 RNAi) of the gene in the clock neurons. Flies expressing these transgenes in all clock neurons do show locomotor activity defects but targeted expression of dUSP8 RNAi in the PDF-expressing LNv does not affect behavioral rhythmicity, nor PER oscillations in the LNv. This suggests that USP8 is involved in other clock neurons(cells).