Méthodes de modulation pour la microscopie tridimensionnelle plein champ : applications à l'imagerie d'échantillons biologiques

Modulation techniques for wide-field three-dimensional microscopy : applications to biological samples imaging

• Auteur / Autrice : Frédéric Chasles
• Direction : Albert-Claude Boccara
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Optique
• Date : Soutenance en 2007
• Etablissement(s) : Paris 6

Mots clés

Mots clés libres

Microscopie tridimensionnelle

Plein champ

Modulation

Détection synchrone multiplexée

Fluorescence

Caméra CCD

Topographie de surface 3D

Résumé

Dans ce manuscrit sont présentées des méthodes de microscopie plein champ permettant de contourner les limites inhérentes au microscope optique : la limite de diffraction et l’impossibilité de séparer les photons provenant du plan de mise au point de ceux provenant du reste de l’échantillon. Elles exploitent les matrices de détecteurs (caméras CCD) couplées à des techniques de modulation et de détection synchrone multiplexée permettant d’extraire en parallèle une information 2D ou 3D sur tous les pixels. Nous avons ainsi pu localiser dans les trois dimensions en seulement 200 ms et avec une précision de 15 nm des objets fluorescents (~ 100 nm) dans une cellule en modulant la position axiale de l’objectif. Nous avons aussi revisité la technique d’illumination structurée en y ajoutant modulation et détection synchrone pour obtenir un microscope confocal plein champ fournissant des coupes optiques de l’échantillon d’une épaisseur de l’ordre de 400 nm en un temps de l’ordre de 200 ms.

In this manuscript, we present wide-field microscopy techniques to bypass the limitations of the optical microscope: the diffraction limit and the impossibility to separate the in-focus and the out-of-focus signals. These techniques are based on the use of matrices of detectors (CCD cameras) coupled to modulation techniques and multiplexed lock-in detection allowing the parallel acquisition of a 2D or 3D information over all the pixels. In a first experience, we were able to localize in the three dimensions, within 200 ms and with a precision of 15 nm, fluorescent particles (diameter ~ 100 nm) inside a cell by axially modulating the position of the objective. In a second experience, we added modulation and lock-in detection to the structured illumination technique to obtain a wide-field confocal microscope providing optical sections of the sample of about 400 nm thick within 200 ms.