Recherche Avancée

Thèse soutenue

Régulation des gènes MUCs 11P15 et MUC4 par les mécanismes épigénétiques et par les facteurs de différenciation cellulaire

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Auteur / Autrice : Audrey Vincent
Direction : Isabelle Van Seuningen
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
Date : Soutenance en 2007
Etablissement(s) : Lille 2

Résumé

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Les quatre gènes MUCs 11p15 (MUC2, MUC5AC, MUC5B, MUC6), organisés en un cluster sur le chromosome 11, codent des O-glycoprotéines de haute masse moléculaire qui participent à la formation de mucus et ainsi à la protection de l'épithélium sous-jacent face à des agressions variées selon la muqueuse considérée (trachéobronche, oesophage, estomac, intestin, voies génitales). Dans le cas de pathologies inflammatoires ou cancéreuses, des anomalies de régulation des gènes codant les mucines aboutissent à un patron d'expression modifié et à une rupture de l'homéostasie épithéliale. Le gène MUC4, localisé sur le chromosome 3 en q29, code une mucine membranaire de très haute masse moléculaire, ligand du récepteur ErbB2. Sa localisation et sa structure lui confèrent un rôle majeur dans les processus de signalisation et de reconnaissance cellulaire. La sur-expression de MUC4 dans de nombreux cancers épithéliaux est associée à des modifications des propriétés biologiques des cellules tumorales en terme de prolifération, d'adhésion et de survie cellulaire. Dans l'adénocarcinome pancréatique, cette sur-expression est associée à un mauvais pronostic de la tumeur. L'étude de la régulation des gènes codant ces mucines est une étape cruciale afin d'élucider les mécanismes moléculaires responsables des altérations de leur patron d'expression et de comprendre leurs fonctions biologiques. Les quatre gènes MUCs 11p15 sont localisés à proximité d'une région soumise à empreinte parentale riche en sites CpG dont le profil de méthylation est altéré dans différents types de cancers. Ces quatre gènes partagent avec MUC4 une forte richesse en nucléotides GC au sein de leurs promoteurs. C'est pourquoi, nous avons étudié la régulation des quatre gènes MUCs 11p15 et de MUC4 par les phénomènes épigénétiques de méthylation et de modifications des histones. Le traitement de lignées cellulaires cancéreuses humaines d'origines épithéliales variées par deux inhibiteurs pharmacologiques, la 5-aza-2'-désoxycytidine (agent déméthylant) et la trichostatine A (inhibiteur des histone désacétylases), nous a permis de montrer l'implication des mécanismes de régulation épigénétique dans la répression des gènes MUCs 11p15 et MUC4. Nous avons ensuite étudié le taux de méthylation des sites CpG au sein des promoteurs des cinq gènes par les techniques de Methylation specific-PCR et de séquençage d'ADN traité par le bisulfite de sodium. Les modifications des histones (acétylation, méthylation) ont été analysées par immunoprécipitation de chromatine (ChIP). L'implication des DNA Methyltransferases (DNMT) et des Histone désacétylases (HDAC) dans la régulation des gènes MUCs a été déterminée par ARN interférence et par ChIP. Les résultats montrent que MUC2 et MUC5B sont soumis à régulation par méthylation et désacétylation des histones. L'inhibition de l'expression de MUC2 par méthylation est site-spécifique tandis que la répression de MUC5B dépend de l'hyperméthylation d'une vaste région de son promoteur distal. Le rôle de la méthylation dans la répression de MUC5B fut confirmé par les premiers résultats obtenus à partir de tissus issus de patients atteints d'adénocarcinome pulmonaire. La répression de MUC2 et MUC5B par méthylation dépend de l'état de différenciation de la cellule et, dans la plupart des cas, est étroitement associée à la désacétylation des histones. En outre, nous avons pu identifier DNMT1 et HDAC2 en tant que régulateurs de l'expression de MUC2 et MUC5B. En revanche, les mécanismes de régulation épigénétique n'interviennent qu'indirectement dans la régulation de MUC5AC et n'interviennent pas pour MUC6. Malgré leur regroupement en cluster, les quatre gènes MUCs 11p15 ne sont donc pas régulés de manière concertée. Nous avons pu mettre en évidence l'importance de cinq sites CpG de la région 5'-flanquante de MUC4, situés à proximité du site d'initiation de la transcription, dont la méthylation, associée à une forte désacétylation des histones, est directement corrélée à la répression du gène. DNMT3A, DNMT3B, HDAC1 et HDAC3 sont directement impliquées dans la régulation épigénétique du gène MUC4. Ainsi, l'analyse du taux de méthylation des cytosines identifiées au sein des promoteurs de MUC2, MUC5B et MUC4 pourrait représenter un outil diagnostique et/ou pronostique précieux dans les étapes précoces de la carcinogenèse. Dans une seconde partie du travail, nous avons étudié la régulation des gènes Muc2 et MUC4 par trois familles de facteurs de transcription impliqués dans la cytodifférenciation de l'épithélium de la sphère aérodigestive : Caudal-Related Homeobox (CDX), GATA et Hepatocyte Nuclear Factors/Forkhead Box A (HNF/FOXA). L'étude de l'expression de Muc2 et Muc4 au cours du développement chez la souris par immunohistochimie nous a permis de montrer que Muc4 est exprimé à partir de E15. 5 selon un patron spatio-temporel spécifique au sein des tractus gastro-intestinal et respiratoire avant et après la cytodifférenciation ; tandis que la mucine Muc2 est exprimée à partir de E17. 5 selon un patron comparable à celui de l'adulte. Par les techniques de cotransfection transitoire, de retard sur gel, de mutagenèse dirigée et de ChIP, nous avons montré que les facteurs Foxa1 et Foxa2 régulent positivement l'expression de Muc2 tandis que les trois familles de facteurs CDX, GATA et HNF/FOXA régulent l'expression de MUC4. Ainsi, Muc2 et MUC4, en tant que cibles de ces facteurs de transcription pourraient jouer un rôle important dans la différenciation terminale de l'épithélium intestinal au cours du développement. D'autre part, la découverte de ces nouveaux éléments concernant la régulation des gènes de mucines est indispensable à la compréhension des mécanismes conduisant aux modifications de leur patron d'expression en situation pathologique, inflammatoire et/ou cancéreuse.