Synthèse, caractérisation et activité biologique de nanotubes de carbone fonctionnalisés

Synthesis, characterisation and biological activity of functionalised carbon nanotubes

• Auteur / Autrice : Davide Pantarotto
• Direction : Alberto Bianco, Maurizio Prato
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Vie
• Date : Soutenance en 2005
• Etablissement(s) : Strasbourg 1 en cotutelle avec Trieste - Italie

Mots clés

Mots clés contrôlés

Thérapie génique

Chimie supramoléculaire

Carbone

Nanotubes

Résumé

Les nanomatériaux représentent actuellement des systèmes très attractifs grâce à leurs propriétés physiques, chimiques et mécaniques particulières. La possibilité de manipuler ce type de structures est à la base d'une nouvelle science appelée nanotechnologie. En particulier, la recherche développée après la découverte de molécules tubulaires baptisées nanotubes de carbone représente une contribution fondamentale aux nanosciences. Les nanotubes de carbone (CNTs) sont constitués par des couches de graphite enroulées pour former des structures cylindriques. Deux catégories existent : les nanotubes de carbone à plusieurs parois concentriques (MWNTs ou Multi Walled carbon nanotubes) et les nanotubes à simple parois (SWNTs ou Single Walled carbon nanotubes). Leur diamètre est de l'ordre du milliardième de mètre ; pour les SWNTs il varie entre 0. 4 nm et 2 nm, et entre 1. 4 et 100 nm pour les MWNTs. La longueur est encore plus variable et est comprise dans les deux cas entre quelques centaine de nanomètres et quelques centaines de microns. Les CNTs sont considérés comme des matériaux uniques ayant des applications très prometteuses, spécialement en nanotechnologie, nanoélectronique, science des matériaux mais aussi en chimie médicinale. Les applications potentielles des nanotubes de carbone en chimie médicinale sont à l'heure actuelle très prometteuses étant donné leur capacité d'interagir avec des macromolécules comme les protéines, les polysaccharides et les oligonucleotides. Jusqu'à ce jour, les applications biologique des nanotubes ont été très peu explorées. La raison majeure est certainement l'absence de solubilité de ce matériau en solution aqueuse. La solubilisation des CNTs dans les solvants organiques est possible après le greffage de groupes solubilisants sur la structure tubulaires. Différentes techniques ont été explorées et des nombreuses réactions chimiques peuvent être utilisées pour cet objectif. Pour étendre les applications des CNTs en chimie médicinale il était absolument nécessaire de développer des méthodes permettant de les solubiliser dans des milieux aqueux. Nous avons ainsi développé une méthode de fonctionnalisation basée sur la réaction de cycloaddition 1,3-dipolaire d'ylure d'azométhine à la surface externe des nanotubes. Les nanotubes de carbone ont ainsi été fonctionnalisés par des groupements aminés solubles en solution aqueuse pouvant être facilement dérivatisés par des acides aminés. Ce travail a représenté la première étape vers la synthèse de premières conjugués peptides-nanotubes. La synthèse, la caractérisation et les éventuelles applications biologiques des nanotubes de carbone fonctionnalisés avec des acides aminés et des peptides n'ont pas été développées et exploitées de manière systématique. Cependant, nous avons immobilisé des peptides ayant une activité biologique sur les parois externes de ces nanotubes de carbone afin de trouver des applications médicales intéressantes. Le potentiel offert par ces nouvelles structures est de pouvoir être utilisé comme système d'intérêt thérapeutique dans des domaines aussi divers que la vectorisation des molécules bioactives (peptidiques ou non peptidiques), la vaccination, ainsi que la multiprésentation des molécules inhibitrices ou activatrices des récepteurs multimériques. Nous pouvons aussi les utiliser dans le domaine du diagnostique. Pour ce faire, différentes stratégies de synthèse ont été utilisées pour préparer des dérivés peptides-nanotubes de carbone qui ont été ensuite testés pour leur activité biologique. Une étude systématique a été conduit in vitro et in vivo afin de vérifier et d'évaluer l'influence de ces molécules à base de carbone sur l'activité biologique du peptide greffé. Nous avons choisi de lier aux nanotubes des peptides ayant des propriétés immuno-modulatrices pour des maladies comme la fièvre afteuse chez les animaux ou le Lupus Erythemateux Disséminé chez l'homme. Les propriétés antigéniques et la réactivité immunologique de ces nouvelles molécules conjuguées ont été vérifiées à l'aide de différentes techniques comme résonance plasmonique de surface (SPR), le test Elisa et par injection directe chez la souris. Nous avons mis en évidence que la présence des nanotubes augmente la réponse de la production d'anticorps in vivo par rapport à l'injection du peptide isolé et en plus, renforce la capacité de ces anticorps à tuer le virus. Les résultats obtenus à ce stade de notre recherche montrent l'énorme potentialité offerte par ces systèmes en ce qui concerne la biocompatibilité et leurs propriétés de délivrance et présentation. L'aspect lié à la toxicité a également été étudiée par cytométrie de flux. De même la capacité des nanotubes de carbone à pénétrer dans les cellules sans détruire les membranes ou les structures cellulaires à été étudié par microscopie à fluorescence. Nous avons montré qu'un nanotube de carbone fonctionnalisé avec une molécule fluorescente est capable de pénétrer dans des cellules bien qu'à l'heure actuelle nous ne connaissons pas encore en détail le mécanisme d'entrée à l'intérieur de la cellule. Apparemment le mécanisme de pénétration le plus probable semble être dû à des phénomènes d'endocitose aspécifiques passives plutôt que par des mécanismes actifs. Les interactions entre la membrane cellulaire et la structure polaire du nanotube fonctionnalisé constituent la force propulsif (driving force) pour l'internalisation du nanotube. Des expériences effectuées en condition d'absence d'énergie cellulaire ont montré la facilité d'internalisation d'un nanotube comme a été confirmé par l'analyse à l'aide de la microscopie électronique à transmission (TEM) des cellules traitées avec les MWNT. Sur la base de ces résultats, nous avons exploré la possibilité d'utiliser les nanotubes comme nouveaux vecteur thérapeutiques. En effet les nanotubes de carbone ont un gros potentiel dans le transport de molécules comme l'ADN ou autres petits médicaments ayant une faible biodisponibilité. Depuis des années les liposomes représentent les vecteurs normalement utilisés afin de véhiculer l'ADN pour des applications en thérapie génique. Après la synthèse d'un dérivé de CNT riche en groupes fonctionnels positivement chargés, il a été possible d'évaluer les interaction entre un nanotube et une molécule d'ADN plasmidique négativement chargée. L'idée était de comparer les deux systèmes de transport : les liposomes et les nanotubes de carbone. Différentes techniques ont été utilisées pour caractériser les complexes obtenus. La microscopie électronique à balayage, à transmission, les études de SPR, PCS et électrophorèse ont permis de montrer la formation du complexe CNT-ADN et de déterminer sa stabilité à différent rapport de charge négatif : positif. La condensation de matériel génétique à la surface de nanotubes fonctionalisés est donc réalisable et applicable pour le développement de nouveaux vecteurs pour la thérapie génique. L'étude de transfection in vitro a démontré l'efficacité du transport et de l'expression du plasmide véhiculé par les nanotubes à l'intérieur de la cellule. Suite à l'injection du complexe CNT-ADN à différentes doses et concentrations, nous avons ensuite évalué la réponse in vivo chez la souris. Le résultats d'expression des gènes ont montré une toutefois faible efficacité, en comparaison avec les liposomes-ADN. La longue optimisation qui a été nécessaire pour l'utilisation des liposomes comme vecteurs non virales dans la thérapie génique, nous donne fort espoir pour l'amélioration de notre système vecteur basé sur les nanotubes de carbone fonctionnalisés. En conclusion dans ce travail de thèse, nous avons réussi à développer et caractériser une nouvelle architecture chimique macromoléculaire fonctionnelle, utilisable comme nouveau outil pour la délivrance de molécules bioactives (médicaments, peptides antigéniques, acides nucléiques) et pour la reconnaissance supramoléculair. Le développement futur de la chimie des nanotubes de carbone et l'optimisation de leurs interactions avec les systèmes vivants constituent la continuation active de ce projet de recherche innovant.

Carbon nanotubes (CNT) consist of graphene sheets rolled-up into a tubular form. Since their discovery, they appeared immediately as an interesting material for technological applications, including for instance the fabrication of nanoelectronic components. Recently, CNT have also attracted much attention for their potential in biological applications. The main difficulty to integrate this material into biological systems derives from its complete lack of solubility in organic solvents and aqueous solutions. The ability to solubilise and separate individual CNT is still a great challenge. A very general way to achieve this is by organic functionalisation, which is a rapidly expanding field. In this thesis, I focused my interests on the synthesis and use of the first water soluble side-wall functionalised carbon nanotubes. I employed the 1,3-dipolar cicloaddition of azomethine ylides to carbon nanotubes. I have demonstrated that it is possible to further derivatise them by coupling single N-protected amino acids. This was the first step towards the preparation of covalently linked peptide-carbon nanotube conjugates. In this context, I have developed a powerful strategy for linking bioactive peptides to carbon nanotubes for immunological applications. Immobilisation of peptides to the external walls of carbon nanotubes may find interesting applications in diagnostics, vaccine and drug delivery or multipresentation of bioactive molecules. For this aim, peptides with immunological properties were selected for their coupling to the external surface of the CNT. The immunological reactivity and the peptide recognition were assessed by a peptide specific antibody using surface plasmon resonance and ELISA test. These experiments showed that the peptide linked to CNT retain its conformational characteristics for antibody recognition. Furthermore, biological studies performed in vivo demonstrated that CNT-peptide conjugates elicited high antibody titers. Significant pathogen neutralising capacity was observed for the antibodies induced by CNT-peptide conjugates. This highlights: 1) the potential of carbon nanotubes for vaccine delivery, and 2) the importance of antigen presentation in vivo for the induction of antibodies with the right specificity. Functionalised carbon nanotubes have been showed able to cross the cell membrane and to accumulate in the cytoplasm or reach the nucleus without being toxic for the cell up to 10 µM concentration. These findings highlight the potential use of peptide-carbon nanotube conjugates for diagnostic purposes and pave the way for their application in vaccine and drug delivery. Although the elucidation of the mechanism of entry requires further investigations, I excluded active ATP dependent endocytosis. This is because inhibitors of endosome-mediated translocation and decrease of the incubation temperature did not prevent cellular uptake of the different functionalised CNT. In addition, TEM images revealed the tubes crossing the cell membrane as nano-needles without any perturbation or disruption of the membrane. Cell viability after treatment with functionalised nanotubes has also been largely investigated. Highly soluble functionalised CNT in aqueous biological media exhibited notably reduced cellular toxicity in vitro. Cell viability was studied using flow cytometry. Following the synthesis of positively charged carbon nanotubes I investigate their interaction with plasmid DNA. The cationic-anionic interaction between CNT and DNA has been characterised by different techniques both qualitatively and quantitatively. TEM, photocorrelation spectroscopy, SPR and electrophoresis allowed to describe the stability of the CNT-DNA complexes. The condensation of genetic material onto the carbon nanotubes was then confirmed and biological test were performed. The excellent ability of the ammonium functionalised carbon nanotubes to enter cells and potentially reach their nuclei was exploited for the delivery of plasmid DNA. In vitro experiments showed a high level of gene expression when mammalian cells were transfected with DNA-CNT complexes. The following success obtained in in vivo treatment of mice, highlighted the possibility to use this system for gene delivery in gene therapy. Preliminary comparative gene expression data between functionalised CNT:DNA and commercially available lipid:DNA delivery systems showed that our first generation CNT-based gene delivery system is less efficient for in vitro transfection than the lipid:DNA system. However, there is a lot of room for further improvement of the carbon nanotube system for gene delivery. In conclusion, in this Thesis it was possible to develop and characterise a new chemical macromolecular architecture exploitable as new tool for molecular delivery, and molecular recognition. The further development of carbon nanotube chemistry, the optimisation of their interaction with biomolecules and their use in biomedical applications represent the future perspectives of this research.