Etude structure / fonction d'hémicellulases thermostables : la xylanase GH-11 et l'arabinofuranosidase GH-51 de Thermobacillus xylanilyticus

Structure / function study of thermostable hemicellulases: the GH-11 xylanase and the GH-51 arabinofuranosidase from Thermobacillus xylanitycus

• Auteur / Autrice : Gabriel Paës
• Direction : Michael O'Donohue
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie et biologie moléculaire
• Date : Soutenance en 2005
• Etablissement(s) : Reims

Mots clés

Mots clés contrôlés

Enzymes microbiennes

Hémicellulose

Glycosidases

Mots clés libres

Xylanase, Arabinofuranosidase, Pont disulfure, Hémicellulase

Résumé

Les enzymes dégradant les hémicelluloses, comme les xylanases ou les arabinofuranosidases, possèdent un fort potentiel en tant que biocatalyseurs dans des applications industrielles. Ces enzymes sont déjà employées dans des secteurs variés comme l'industrie du papier dans l'étape du blanchiment de la pâte à papier, l'alimentation animale où elles permettent d'accroître la valeur nutritionnelle, l'industrie du vin pour favoriser la libération des arômes, etc. De plus, les hémicellulases apparaissent comme des éléments essentiels dans le futur développement de bioraffineries qui convertiront les déchets agricoles en carburant et autres produits chimiques. Pour améliorer notre compréhension des motifs structuraux qui jouent un rôle dans la fonctionnalité des hémicellulases, nous avons étudié la relation structure/fonction d'enzymes appartenant à deux familles d'hémicellulases. La technique de mutagenèse dirigée a été employée pour explorer différents aspects fonctionnels d'une xylanase GH-11 thermostable (Tx-Xyl), et une analyse cristallographique a été menée sur une arabinofuranosidase GH-51 thermostable (Tx-Abf), ces deux enzymes étant issues du micro-organisme Thermobacillus xylanilyticus. Concernant Tx-Xyl, à la fois sa thermostabilité et un des ses motifs structuraux majeur (le " pouce ") ont été étudiés. Dans le but d'augmenter sa thermostabilité et donc le rendement de dégradation de la biomasse lignocellulosique, une stratégie déjà connue consistant en l'introduction de ponts disulfures a été utilisée. Un mutant affichant un temps de demi-vie à 70°C accru (par un facteur 10) et une plus forte activité spécifique (+ 30%) a été obtenu. Par ailleurs, ce mutant est capable de mieux dégrader les arabinoxylanes constituant le son de blé. Mais de manière surprenante, cette augmentation n'est pas due à la meilleure thermostabilité du mutant. À partir d'études de modélisation moléculaire, des modifications de la composition en acides aminés du pouce de Tx-Xyl sur des positions clés ont contribué à augmenter ou diminuer l'activité catalytique. La suppression du pouce par mutagenèse dirigée a entraîné un changement de spécificité de substrat, et a aboli l'activité enzymatique. En particulier, l'enzyme sans pouce a acquis la faculté de fixer le cellotétraose, sans pour autant que ce ligand ne soit hydrolysé. Enfin, l'étude par cristallographie de Tx-Abf a fourni un modèle structural de cette enzyme à une résolution de 2,1 Å. Cette nouvelle structure, la deuxième dans la famille GH-51, a montré que le domaine catalytique possède une architecture en (b/a)8 et aussi la présence d'un domaine en jelly-roll de fonction inconnue. En comparaison avec l'unique autre structure existant dans cette famille GH-51, Tx-Abf comporte deux ponts disulfures dont l'un est proche du site actif. De plus, la topologie de la crevasse des deux enzymes s'avère différente. La mutagenèse dirigée du résidu Trp248 a révélé son rôle essentiel pendant l'hydrolyse d'arabinoxylo-oligosaccharides de DP3 ou plus.

Hemicellulose-degrading enzymes such as xylanases and arabinofuranosidases are potentially useful as biocatalysts for industrial applications. Theses enzymes are already used in numerous sectors such as paper industry for paper pulp whitening, in animal feed preparation to increase nutritional value, in the wine industry to improve bouquet properties etc. In addition, hemicellulases will be key enzymes for the future development of biorefineries which will convert agricultural wastes into transport fuels and other renewable chemicals. To increase understanding of the structural features that are important for the functionality in hemicellulases, we have studied structure/function relationships in enzymes belonging to two hemicellulases families. Directed mutagenesis methods have been used to probe different functional aspects in a thermostable GH-11 endoxylanase (Tx-Xyl), and a crystallographic analysis has been used to study a thermostable GH-51 arabinofuranosidase (Tx-Abf), both enzymes being from Thermobacillus xylanilyticus. Tx-Xyl has been studied with regard to its thermostability and with regard to one of its major structural features, the “thumb”. In order to increase thermostability and hence the usefulness for the degradation of lignocellulosic biomass, an already-tested strategy involving the introduction of disulphide bonds was used. A mutant that exhibits both an increased (10-fold) half-life at 70°C and higher specific activity (30% increase) has been obtained. Gratifyingly, this mutant also displays an increased aptitude for the hydrolysis of arabinoxylans embedded in wheat bran. However, intriguingly, this increase is independent of the increased thermostability. On the basis of a molecular modelling study, modifications of the amino acid composition of Tx-Xyl thumb at key positions lead to increased or decreased catalytic activity. The abolition of the thumb by deletion mutagenesis altered substrate selectivity, and destroyed catalytic activity. In particular, the thumbless enzyme acquired the ability to fix cellotetraose, although this ligand could not be hydrolysed. Finally, a crystallographic study of Tx-Abf has provided a structural model for this enzyme at a resolution of 2. 1 Å. This new structure, the second for GH-51, revealed that the catalytic domain exhibits (b/a)8 architecture and the presence of a jelly-roll domain of unknown function. Compared to the only available structure for GH-51, Tx-Abf contains two putative disulphide bridges, one of which is close to the catalytic apparatus. In addition, the architecture of the catalytic cleft is topologically different to that of the other GH-51 structure. Site-directed mutagenesis of Trp248 has indicated an essential role for this residue in the hydrolysis of arabino-xylo oligosaccharides having a size of DP3 or more