Réaction d'hydroxylation aromatique catalysée par une hydroxylase flavine-dépendante à deux composants : le système ActVA-ActVB de Streptomyces coelicolor

An aromatic hydroxylation reaction catalyzed by a two-component FMN-dependent monooxygenase : the actVB-actVA system from streptomyces coelicolor

• Auteur / Autrice : Julien Valton
• Direction : Vincent Nivière, Marc Fontecave
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
• Date : Soutenance en 2005
• Etablissement(s) : Université Joseph Fourier (Grenoble ; 1971-2015)

Résumé

Il y a une dizaine d'années, de nouvelles flavoenzymes nommées hydroxylases flavine-dépendantes à deux composants ont été identifiées chez certains microorganismes. Le rôle physiologique de ces enzymes est maintenant bien connu. Elles sont impliquées dans les processus de biosynthèse et de biodégradation d'une multitude de molécules organiques. Ces hydroxylases sont composées de deux enzymes distinctes. La première est une flavine réductase qui catalyse la formation de flavine réduite nécessaire au fonctionnement de la seconde enzyme, une monooxygénase flavine-dépendante. Au début de notre projet, le mécanisme enzymatique de ces nouvelles hydroxylases était encore inconnu. Pour comprendre le détail de leur fonctionnement, nous avons choisi d'étudier le système ActV A-ActVB, un nouveau membre de la famille des hydroxylases flavine-dépendantes impliqué dans la dernière étape de biosynthèse de l'actinorhodine, un antibiotique naturel synthétisé par Streptomyces coelicolor. ActVB est une NADH :FMN oxydoréductase capable de catalyser la réduction du FMN par le NADH selon un mécanisme de type séquentiel ordonné. Nos résultats ont permis d'identifier ActV A-Orf5, une monooxygénase flavine-dépendante capable d'utiliser la flavine réduite fouurnie par ActVB pour catalyser. J 'hydroxylation du précurseur de l'actinorhodine, la DHK. Le transfert de flavine entre les deux protéines est sous contrôle thermodynamique. Une fois transferée à ActV A, la flavine réduite réagit avec l'oxygène pour former un intermédiaire hydropéroxyflavine, un oxydant puissant capable d'hydroxyle la DHK - le précurseur de l'actinorhodine - en DHK-OH.

The two-component flavin-dependent monooxygenases belong to an emerging class of enzymes involved in oxidation reactions in a number of metabolic and biosynthetic pathways in microorganisms. One component is a NAD(P)H : flavin oxidoreductase which provides a reduced flavin to the second component, the proper monooxygenase. Here, we study the two-component system ActVB and ActV A-OrF5, reported to be involved in the last step ofbiosynthesis of the natural antibiotic actinorhodin in Streptomyces coelicolor. ActVB has been already reported to be a NADH : flavin oxidoreductase able to catalyze the reduction of free flavin by NADH by a sequential ordered mechanism. Here, for the first time, we show that ActV A Orf5 is an FMN-dependent monooxygenase which together with the help of ActVB, catalyze the aromatic hydroxylation of its natural substrate DHK. The mechanism of the transfer of FMN between ActVB and ActV A-Orf5 has been investigated. Dissociation constant values for FMNox and FMNred with regard to ActVB and ActV A-Orf5 have been determined. The results clearly demonstrate that FMNred has a better affinity for ActV A than for ActVB whereas FMNox has a better affinity for ActVB than for ActV A. Ln full agreement with this finding, our data clearly indicate a thermodynamic transfer of FMNred from ActVB to ActV A-Orf5, without involving a particular interaction between the two protein components. Ln addition, we show that in the presence of FMNred and molecular oxygen, the ActV A active site accommodates and stabilizes an electrophilic hydroperoxyflavin intermediate species. This intermediate reacts efficiently with the nucleophilic species DHK to form its hydroxylated analogue : DHK-OH