Etude des interactions entre la peptidyl-prolyl cis/trans isomérase Pin1 et la protéine microtubulaire tau : recherche d'inhibiteurs ciblant la liaison de Pin1 à ses substrats phosphorylés

• Auteur / Autrice : Caroline Smet-Nocca
• Direction : Guy Lippens
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie organique
• Date : Soutenance en 2004
• Etablissement(s) : Lille 2

Mots clés

Mots clés contrôlés

Spectroscopie par résonance magnétique

Interphase

Protéines tau

Peptidylpropyl isomerase

Spectroscopie de la résonance magnétique nucléaire

Liaisons chimiques

Proline

Résumé

La phosphorylation et l'isomérisation constituent deux mécanismes de régulation de la fonction biologique des protéines liés au contrôle des associations inter-moléculaires, de l'activité enzymatique ou de la liaison de ligands. Ces deux mécanismes de signalisation cellulaire sont étroitement liés par l'intermédiaire d'enzymes catalysant l'isomérisation cis/trans des prolines au niveau de motifs Ser/Thr-Pro phosphorylés telles que les peptidyl-prolyl cis/trans isomérases de la famille de Pin1. Elles jouent un rôle cellulaire essentiel mais leur fonction biologique exacte est encore mal connue. Les interactions moléculaires entre Pin1 et de nombreuses phospho-protéines mitotiques indiquent un rôle dans la régulation du cycle cellulaire et dans l'oncogénèse, et font de Pin1 une cible pharmacologique émergente dans le traitement des cancers. Récemment, des interactions avec la protéine microtubulaire Tau dans sa forme pathologique hyperphosphorylée, au niveau d'un site unique centré autour de l'épitope Thr231-Pro232, pourraient impliquer Pin1 dans la régulation de la liaison de Tau aux microtubules et dans les phénomènes de neurodégénérescence observés dans la maladie d'Alzheimer. Nous avons ciblé les interactions entre Pin1 et la protéine Tau comme modèle de substrats pour une étude détaillée des mécanismes intervenant à l'échelle moléculaire, sur base de substrats peptidiques, qui permettraient d'expliquer le rôle fonctionnel de Pin1. L'interaction avec les substrats au travers des épitopes Ser/Thr-Pro phosphorylés est double : un domaine de liaison WW permet la liaison du substrat et un domaine catalytique PPIase (peptidyl-prolyl isomérase) catalyse l'isomérisation cis/trans des prolines. Un criblage par RMN des différents motifs phospho-Ser/Thr-Pro au sein de la protéine Tau a permis de déterminer un nouveau site d'interaction centré autour de l'épitope Thr212-Pro213, un épitope phosphorylé uniquement dans la forme pathologique de Tau. Nous avons étendu l'investigation des interactions avec Pin1 à l'échelle de la protéine Tau entière. Comme pour la plupart des régions protéiques impliquées dans les interactions avec Pin1, la protéine Tau se caractérise par une absence de structure globale qui limite considérablement les études par RMN. Un fragment peptidique de 40 acides aminés comprenant les épitopes Thr231 et Thr212 a permis de montrer un rôle régulateur du domaine WW dans l'activité enzymatique. Une première étude avec une protéine mutante mimant l'état phosphorylé de Tau a montré une interaction avec le domaine catalytique de Pin1 et a nécessité la mise au point préalable d'une technique d'attribution de la protéine par RMN basée sur les déplacements chimiques « random coil ». La phosphorylation du domaine WW de Pin1 est associée à l'inhibition de la liaison des substrats et joue un rôle dans la régulation de l'activité de Pin1 in vivo. La forme non phosphorylée active de Pin1 est retrouvée dans les cellules cancéreuses et la forme phosphorylée inactive dans les cellules saines. Nous avons envisagé de cibler les interactions entre Pin1 et ses phospho-épitopes avec la synthèse de molécules organiques mimant le dipeptide phosphoThr-Pro et la mise en œuvre d'un test de criblage par RMN pour l'obtention d'inhibiteurs ciblant le domaine WW de Pin1 qui pourraient mimer la forme inactive de la protéine.

Phosphorylation is a major cellular process involved in regulation of protein function controlling inter-molecular associations, enzymatic activity, or ligand binding. Isomerisation of Ser/Thr-Pro peptidic bonds, phosphorylated by Pro-directed kinases, mostly involved in cell cycle control, stands as a novel regulation mode of protein function. Both signalling pathways are tightly related to through enzymes catalyzing the cis/trans isomerization process in phosphorylated Ser/Thr-Pro motifs as Pin1-type peptidyl-prolyl cis/trans isomerases (PPIases). Although Pin1 and homologous have an essential cellular role, their real molecular function remains still unclear. Molecular interactions between Pin1 and numerous phospho-proteins indicate a critical implication of Pin1 in cell cycle regulation and oncogenesis, and point out a relevant role as an emergent target in cancer treatment. Recently, interactions with the microtubule-associated Tau protein under its pathological hyperphosphorylated form, mediated by the unique phosphoThr231-Pro232 motif, could involve Pin1 in the regulation of Tau microtubule binding and in the Alzheimer's disease (AD) neuronal disorders. We have targeted the interactions between Pin1 and Tau using small peptidic substrates to study the molecular processes that could explain the functional role of Pin1. Interactions with substrates through the phosphorylated Ser/Thr-Pro motifs are double : a WW binding domain is responsible for the substrate binding and the PPIase-type catalytic domain accelerates the cis/trans isomerization of proline bonds. A NMR screening of various phospho-Ser/Thr-Pro motifs encompassed in Tau protein points out a novel interacting site centered around the phosphoThr212-Pro213 motif, an AD-specific phosphorylation site. We have extended investigations with Pin1 at the Tau full-length protein level. As for most of Pin1 substrates, Tau is characterized by a global absence of structuration that limits NMR studies. A regulatory role on enzymatic activity was shown for the WW domain through a peptidic fragment of 40 residues containing both Thr231 and Thr212 phosphorylated sites. Interactions with a mutant mimicking the phosphorylated form of Tau have been detected with the Pin1 catalytic domain involving an NMR assignment of the Tau protein based on peptide assignments so called “peptide mapping”. Phosphorylation of the Pin1 WW domain associated with inhibition of the binding function plays a regulatory role in Pin1 activity in vivo. The non-phosphorylated active form of the protein is mostly found in cancer cells and the phosphorylated inactive form in safe tissues. We have targeted interactions between Pin1 and phospho-peptides based on the synthesis of small-molecules mimicking the phosphoThr-Pro dipeptide and performing high resolution NMR to investigate potential ligands targeting the Pin1 WW binding domain that could mimic the inactive form of the protein.