La recombinaison spécifique de site chez les archaea : propriétés de l'intégrase du fusellovirus SSV1
Auteur / Autrice : | Claire Bordes-Letzelter |
Direction : | Michel Duguet |
Type : | Thèse de doctorat |
Discipline(s) : | Sciences biologiques |
Date : | Soutenance en 2003 |
Etablissement(s) : | Paris 11 |
Partenaire(s) de recherche : | autre partenaire : Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne) |
Résumé
SSV1 est un fusellovirus découvert chez l'archaea thermoacidophile Sulfolobus shibatae B12. SSV1 s'intègre dans le génome de son hôte par un mécanisme de recombinaison spécifique de site catalysé par l'intégrase virale, IntSSV. La réaction intervient entre un site ADN chromosomique attB et un site viral attP. Une bonne connaissance du cycle vital ainsi que la maîtrise du système d'intégration/excision sont des étapes essentielles au développement d'un vecteur performant basé sur SSV1. Nous avons développé différents tests d'activité pour étudier le mécanisme catalytique d'IntSSV. Nous avons de plus généré des mutants ponctuels d'IntSSV ainsi que des mutants ponctuels du site attP. L'étude de ces différents sites et protéines a révélé certaines propriétés de SSV1. En particulier, nous avons montré que l'affinité d'Intssv pour ses sites est faible, mais meilleure pour attP que pour attB, suggérant que des protéines accessoires sont nécessaires à la réaction de recombinaison. La position exacte de la coupure a été identifiée sur un substrat synthétique dérivé du site atfP. L'étude de mutants ponctuels du site attP a mis en évidence des positions importantes pour que la coupure intervienne. Des mutations ponctuelles qui bloquent l'activité de coupure de la protéine ont ainsi été identifiées. L'analyse des propriétés des mutants d'Intssv a montré que cette intégrase fait partie de la famille des tyrosine recombinases, et que l'organisation du site actif de cette protéine d'archae est de type eucaryote. L'introduction dans le génome viral de mutations affectant soit l'intégrase soit le site attP est en cours. L'étude de ces virus mutants permettra d'identifier la forme réplicative de SSV1, et donc de mieux comprendre le cycle viral.