Identification de ligands oligonucléotidiques des structures Arn du génome du virus de l'hépatite C

Identification of oligonucleotidic ligands of hepatitis c genome Rna structures

• Auteur / Autrice : Lydia Aldaz-Carroll
• Direction : Jean-Jacques Toulmé
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et médicales. Biologie-Santé
• Date : Soutenance en 2001
• Etablissement(s) : Bordeaux 2

Mots clés

Mots clés contrôlés

Génétique

Hépatite C

ARN viral

Acides nucléiques antisens

Génome

Virus de l'hépatite C

Résumé

Le virus de l'Hépatite C (VHC) est un problème majeur de santé publique. Toute recherche visant à améliorer nos connaissances sur ce virus peut avoir des retombées importantes. Nous avons ciblé par des stratégies oligonucléotidiques deux structures ARN cruciales pour le développement du virus : l'élément 3'X et l'IRES. La structure 3'X es située en 3' de l'ARNm et joue un rôle lors de la traduction et de la réplication de l'ARN génomique viral. Nous avons utilisé la stratégie de sélection in vitro pour identifier des aptamères (structures ARN) capables de se lier à cette structure. Une technique de sélection multi-cible, dirigée contre plusieurs tige-boucles du 3'X (SL1 et SL3), a pu être validée. Des aptamères présentant un motif consensus dans une boucle interne complémentaire à la boucle apicale de SL1 ont été sélectionnés. Ces aptamères forment un nouveau type de complexe, nommé ALIL (Apical Loop-Internal Loop), avec SL1. Les résidus connecteurs entre la boucle interne et les tiges sont cruciaux pour la formation du complexe, ainsi que la tige-boucle apicale de l'aptamère. Ce complexe diffère des complexes kissing déjà décrits impliquant une interaction entre deux boucles apicales : en effet, le complexe ALIL n'est pas reconnu par la protéine ROP. Nous avons testé plusirurs de ces molécules pour leur effet sur la traduction ou sur la synthèse d'ARN in vitro. Aucun effet n'a pu être démontré sur la traduction in vitro, cependant, un IC50 de 1 (micron)M a été détecté sur la synthèse d'ARN in vitro pour un aptamère formant un complexe ALIL avec SL1. L'IRES est une structure ARN en 5' de l'ARNm contenant le site interne d'entrée du ribosome. Nous avons identifié un oligonucléotide antisens inhibiteur de la traduction, avec un IC50 de 1 nM in vitro. En conclusion, la technique de sélection in vitro a mené à l'identification d'un nouveau motif de reconnaissance entre deux ARN structurés.

The Hepatitis C Virus (HCV) is a major problem of public health. Any search aiming at improving our knowledge on this virus is of potential interest. We targeted the crucial viral RNA structures IRES and the 3'X element, using oligonucleotidic strategies. The 3'X structure is located at the 3'end of mRNA and plays a role during the translation and replication of the viral RNA. We used in vitro selection to identify aptamers (RNA structures) able to bind to this structure. We were able to validate a multi-target selection, directed against several stem-loops of the 3'X (SL1 and SL3). Aptamers presenting a consensus in an internal loop complementary to the apical loop of SL1 were selected. These aptamers form a new type of complex, named ALIL (Apical Loop-Internal Loop), with SL1. The residues connecting the internal loop with the stems and the aptamer's apical stem-loop are crucial for the formation of the complex. The complex differs from previously described kissing complexes implicating an interaction between two apical loops : indeed, the ALIL interaction is not recogbized by the ROP protein. We tested several of these molecules for their effect on the translation or the in vitro synthesis RNA. No effect could be shown on the translation, however, an inhibition constant of 1(micron)M was detected on the in vitro RNA synthesis. The IRES is an RNA structure at the 5' end of the viral mRNA containing the internal ribosomal entry site. We identified a potent antisens oligonucleotide able to reduce by 50 % the in vitro translation of IRES-dependent reporter gene at 1 nM oligonucleotide. In conclusion, the technique of in vitro selection led to the identification of a new recognition motif between two structured RNAs