Repliement d'acides nucléiques riches en cytosines : du contrôle artificiel de l'expression des gènes à la reconnaissance par des protéines cellulaires

• Auteur / Autrice : Laurent Lacroix
• Direction : Jean-Louis Mergny
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 2000
• Etablissement(s) : Paris, Muséum national d'histoire naturelle
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Christiane Garbay, Claude Hélène, Jean-Jacques Toulmé, Olivier Delattre, Jean-Louis Mergny
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Maurice Guéron, Éric Gilson

Mots clés

Mots clés contrôlés

Acides nucléiques

Résumé

Le motif i est une structure d’ADN à 4 brins impliquant la formation de paires C. C + hémiprotonées et intercalées. Dans le cadre de la stratégie anti-gène, nous avons étudié l'effet de modifications chimiques d'oligonucléotides sur la formation du motif i, structure qui peut entrer en compétition avec la formation de la triple-hélice pyrimidique. Ces deux structures, nécessitant la protonation des cytosines, sont plus stables a ph acide. Certaines modifications chimiques (ARN, 2-o-methyl) déstabilisent le motif i et stabilisent la triple-hélice alors que, dans le cas des propynyl-uraciles, le motif i est stabilise au détriment de la triple-hélice. La formation d'une triple-hélice avec un oligonucléotide possédant des unités morpholinos à la place des sucre a été démontrée. A ph neutre et 140 mM KCI en présence 10 mm mg 2 +, la triple-hélice avec un troisième brin N3’P5’ phosphoramidate est la plus stable alors qu'en présence de concentrations d'ions magnésium faibles ou nulles (1 mm), seule la triple-hélice avec un troisième brin morpholino se forme. Un oligonucléotide mimant le brin riche en cytosines des répétitions télomériques des vertébrés (C3TA2)n peut former un motif i a pH physiologique, mais la stabilité de ce dernier est modérée (tm20\c). Des protéines reconnaissant ce type de séquence et éventuellement stabilisant le motif i pourraient jouer un rôle au niveau des télomères. Nous avons mis en évidence l'existence d'au moins 3 facteurs protéiques présents dans les extraits nucléaires de cellules HeLa et capables de fixer cette séquence de manière très spécifique. En criblant une banque de cDNA de cellules HeLa, nous avons identifié deux protéines, hnRNP K et ASF/SF2. Nous avons confirmé la spécificité de cette reconnaissance à l'aide de protéines recombinantes et d'anticorps. Dans le cas de , hnRNP K, nous avons aussi déterminé que le domaine KH carboxyterminal (kh3) suffisait à cette reconnaissance. Pour ASF/SF2, les domaines aminoterminaux RRM1 et RRM2 sont impliqués dans la fixation des répétitions télomériques. La recherche d'autres protéines pouvant reconnaitre ce type de séquence et la caractérisation de la structure de l'oligonucléotide associé à ces protéines sont importantes pour la compréhension d'un éventuel rôle télomérique du motif i