Étude d'un complexe membranaire impliqué dans le transfert d'électrons vers la nitrogénase chez Rhodobacter capsulatus

• Auteur / Autrice : Ho-Sang Jeong
• Direction : Yves Jouanneau
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Soutenance en 2000
• Etablissement(s) : Grenoble 1

Mots clés

Mots clés libres

Microbiologie

Sciences medicales

Dermatologie

Rhodobacter capsulatus

Nitrogenase

Transfert electron

Fixation azote

Ferredoxine

Centre fer soufre

Proteine

Gene nrf

Résumé

La fixation d'azote est catalysee par la nitrogenase, enzyme dont le fonctionnement necessite une source d'electrons a bas potentiel. Dans la bacterie photosynthetique rhodobacter capsulatus, l'analyse genetique a mis en evidence qu'un ensemble de genes, appeles rnf, essentiels a la fixation de l'azote, et susceptibles de coder un systeme de transport d'electrons specifique a la nitrogenase. Les genes rnf ont ete separement clones et surexpimes dans e. Coli sous forme de proteines recombinantes portant une etiquette polyhistidine. Parmi les proteines recombinantes obtenues dans e. Coli, rnfb et rnfc, ont ete purifiees et caracterisees par spectroscopie uv-visible et rpe. Rnfb est une proteine de 19 kda possedant un centre 2fe-2s. Rnfc est une proteine de 55 kda possedant au moins un centre 4fe-4s, et plus probablement deux centres de ce type. Rnfb et rnfc sont toutes deux des proteines hautement instables qui s'inactivent a l'air. L'etude de rnfc par spectroscopie de fluorescence a montre que cette proteine contient un site de fixation pour le nad(h) et qu'elle interagit specifiquement avec la ferredoxine i (fdi) de r. Capsulatus qui a ete identifiee comme le donneur d'electrons a la nitrogenase. La complementation de mutants rnf de r. Capsulatus par le plasmide pnr117 portant l'operon rnf, a prouve que toutes les proteines rnf synthetisees grace a cette construction etaient fonctionnelles. L'activite nitrogenase mesuree in vivo dans des souches contenant pnr117 s'est avere superieure de 50 a 100% par rapport a celle de la souche sauvage. D'apres les analyses quantitatives du contenu des bacteries en polypeptides constitutifs de la nitrogenase, ainsi qu'en proteines rnfb et rnfc, cette augmentation d'activite a ete correlee a un taux de synthese accru des polypeptides rnf. Nous en avons conclu que le transfert d'electrons a la nitrogenase, medie par les proteines rnf, est un facteur limitant de l'activite de l'enzyme in vivo. En outre, des experiences d'immunoprecipitation ont montre que rnfb et rnfc, proteines hydrosolubles, etaient associees a au moins quatre composants membranaires de r. Capsulatus. Sur la base de ces resultats et de comparaisons avec une nadh-oxydoreductase presentant des similitudes de sequence, nous proposons un modele selon lequel les proteines rnf formeraient un complexe membranaire de type ferredoxine-oxydoreductase, dont le fonctionnement serait dependant du potentiel electrochimique de membrane.