Étude de la phosphorylation du facteur cytosolique p40phox dans l'activation du complexe NADPH-oxydase des neutrophiles

• Auteur / Autrice : Anne-Pascale Bouin
• Direction : Pierre Vignais
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Soutenance en 1999
• Etablissement(s) : Université Joseph Fourier (Grenoble ; 1971-2015)

Mots clés

Mots clés libres

Biochimie analytique. Structurale et metabolique

Mammalia

Neutrophile

Phagocytose

Reponse immune

Nadph peroxidase

Activite enzymatique

Activation

Phosphorylation

Hyperoxyde

Résumé

Le complexe enzymatique nadph oxydase des neutrophiles est responsable de la production d'ions superoxyde o 2 qui participent a la destruction des micro-organismes infectieux. Ce complexe est constitue de composants membranaires et cytosoliques, qui s'associent lors de l'activation. L'activation de la nadph oxydase semble mettre en jeu des phosphorylations ainsi que des interactions entre les composants du complexe. La phosphorylation de p47 p h o x avait ete decrite dans la litterature et nous avons mis en evidence une phosphorylation de p40 p h o x correlee a l'activite oxydase. Le but de ce travail a ete d'identifier la ou les proteine(s) kinase(s) qui phosphoryle(nt) p40 p h o x et d'etudier le role de cette phosphorylation. Nous avons montre que p40 p h o x est phosphorylee in vitro par la proteine-kinase-c (pkc) et par la caseine-kinase ii (ck-ii) qui possedent des sites potentiels de phosphorylation sur p40 p h o x. Nous avons montre que p40 p h o x n'est pas phosphorylee lorsque les cellules ont ete traitees avec un inhibiteur de pkc avant l'activation. La production d'ions superoxyde est egalement inhibee dans ces conditions. Par la mutation des sites consensus de phosphorylation par la pkc, nous avons montre que la threonine 154 et la serine 315 sont phosphorylees in vivo. Nous avons donc realise des constructions dans lesquels les sites de phosphorylation identifies (t154 et s315) ont ete mutes de facon a empecher ou a mimer la phosphorylation. Ces proteines mutantes ont ete transfectees dans des cellules exprimant tous les composants de la nadph oxydase sauf p40 p h o x. Nous avons selectionne des lignees stables, clonales, exprimant, p40 p h o x sous sa forme native ou mutee. L'etude des clones obtenus nous a permis de mettre en evidence un role inhibiteur de p40 p h o x, mutee ou non mutee, sur la production d'ions superoxyde. Cette inhibition est identique dans des clones exprimant fortement ou tres faiblement p40 p h o x. Ceci suggere un mecanisme d'action de p40phox plus complexe qu'attendu.