Etude d'un procede de focalisation isoelectrique operant en regime continu : application a la purification de proteines

Study of a continuous flow isoelectric focusing process : application to the purification of proteins

• Auteur / Autrice : NATHALIE SOULET
• Direction : Victor Sanchez
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1998
• Etablissement(s) : Toulouse 3

Résumé

L'objet de ce travail est l'etude d'un procede de focalisation isoelectrique fonctionnant en regime continu. Lorsqu'elle est mise en oeuvre au sein d'une veine liquide, la focalisation isoelectrique, qui consiste, sous l'effet d'un champ electrique, a separer des especes amphoteres en fonction de leur point isoelectrique (valeur particuliere de ph pour laquelle la charge globale est nulle), permet de travailler a l'echelle preparative. Toutefois, le maintien de la stabilite hydrodynamique du liquide est le probleme majeur, par suite de gradients solutaux dus au transfert de masse et de chaleur et aux faibles valeurs du nombre de reynolds necessaires pour avoir des temps de sejour compatibles avec la focalisation. Les travaux sur l'electrophorese a ph constant en regime continu ont montre l'existence d'effets dispersifs qui alterent la resolution du procede ; en focalisation isoelectrique, d'autres problemes specifiques viennent se greffer. La faisabilite du procede a ete montree en etudiant la formation d'un gradient de ph stable et reproductible, et la focalisation d'une proteine modele. Le parametre operatoire qui regit le procede est determine comme etant le produit du champ electrique e par le temps de sejour moyen. Le travail montre qu'un gradient de ph est obtenu si la valeur de ce parametre est comprise entre deux valeurs, la valeur maximale correspondant a celle au dela de laquelle l'ecoulement est hydrodynamiquement instable. Par une approche theorique, l'origine thermique de ces instabilites est determinee. Dans le cas de la focalisation de proteines, la valeur maximale reste inchangee, alors que la valeur minimale augmente. Pour aborder la separation de melanges de proteines, la resolution qui correspond a la difference entre les points isoelectriques de deux proteines pouvant etre separees, a ete estimee. Une approche theorique a montre que la resolution obtenue dans nos conditions de fonctionnement est toujours limitee par le phenomene de dispersion du a l'electrohydrodynamique, et qu'elle est superieure a celle qui serait obtenue si l'etat stationnaire de focalisation etait veritablement atteint. Une etude experimentale concernant la separation de melanges de proteines modeles a ensuite ete effectuee dans des conditions reduisant au maximum l'electrohydrodynamique, c'est-a-dire permettant d'atteindre la meilleure resolution. Les resultats obtenus ont ete conformes a ceux prevus par la theorie. Au cours de ce travail, les approches experimentale et theorique developpees ont permis de decrire et de comprendre le mode de fonctionnement du procede qui s'avere etre un outil rapide pour estimer les points isoelectriques voisins de macromolecules. Cependant, le choix d'une cellule utilisee en electrophorese a ph constant n'est pas adapte pour avoir une resolution comparable a celle obtenue a l'echelle analytique. Afin d'ameliorer la resolution, une modification de la geometrie de la cellule s'avere etre un parametre primordial.