Caracterisation moleculaire du site de liaison des bloquants non competitifs sur les recepteurs gaba#a a l'aide de marqueurs irreversibles. Application a l'etude du site de liaison du fipronil

Molecular characterization of the channel blockers binding site of gaba#a receptors using irreversible labeling. Investigation of the fipronil binding site

• Auteur / Autrice : Philippe Perret
• Direction : Maurice Goeldner
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences médicales
• Date : Soutenance en 1998
• Etablissement(s) : Strasbourg 1

Résumé

L'acide -aminobutyrique (gaba), principal neuromediateur du snc exerce principalement ses effets par l'intermediaire du recepteur gaba#a. Ce recepteur est une glycoproteine composee de 5 sous-unites s'arrangeant dans la membrane pour former un canal permeable aux ions chlorure. Ce recepteur peut aussi lier les benzodiazepines, les barbiturates, les steroides et les bloquants non-competitifs (bnc) qui modulent de maniere allosterique l'action du gaba. Les bnc, par leurs effets convulsivants representent un groupe d'insecticides potentiels tres puissants, parmi lesquels le fipronil, developpe par rhone-poulenc. Leur site de liaison est probablement etroitement lie au canal chlorure. Pour confirmer cette hypothese, deux approches de marquage irreversible ont ete utilisees. Le photomarquage avec des derives arylazides photosensibles du fipronil a permis d'inactiver 10% des sites de liaison #3htbob. L'absence de sonde radioactive n'a pas permis l'identification des sites d'incorporation apres photomarquage. L'introduction de cysteines par mutagenese dirigee au sein du canal ionique, combinee a la conception et a la synthese de ligands electrophiles derives du fipronil et d'autres bnc represente la seconde approche originale utilisee. L'expression des recepteurs recombinants #1#1#2 dans des oocytes de xenopes, puis l'etude de l'effet irreversible induit par les marqueurs d'affinite sur les mutants cysteines a permis d'identifier les residus #1val257 et #1ser272 du segment transmembranaire m#2 formant les parois du canal ionique comme directement impliques dans la liaison des bnc. Ces resultats confirment la liaison des bnc au sein du canal ionique et l'implication du residu val257 dans celle-ci et proposent l'existence d'un deuxieme site de liaison a proximite de ser272c. Ils permettent egalement d'elaborer de nouvelles hypotheses quant a la structure moleculaire du site de liaison des bnc.