Etude par spectroscopie et electrophorese capillaire de la migration d'adn en gel et en solution de polymeres

• Auteur / Autrice : SOFFIA MAGNUSDOTTIR
• Direction : Jean-Louis Viovy
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences et techniques
• Date : Soutenance en 1998
• Etablissement(s) : Paris 6

Résumé

Ce memoire presente une serie d'etudes experimentales destinees a ameliorer la comprehension des mecanismes moleculaires mis en jeu durant la separation electrophoretique de l'adn, et a utiliser cette comprehension pour ameliorer les performances de la technique. L'electrophorese de l'adn est un outil incontournable de tour projet en genetique, et est plus que jamais employee massivement dans le cadre des grands projets de sequencage du genome. Dans une premiere etude, on a employee le dichroisme lineaire (ld) pour suivre l'orientation d'adn double brin en cours d'electrophorese en gel d'agarose, afin d'identifier les modes de migration en fonction de la taille de l'adn et du champ electrique applique. Nous avons utilise les caracteristiques du profil de croissance ld a l'etablissement du champ, et de decroissance a l'arret du champ ; pour identifier les transitions entre ces modes de migration l'electrophorese capillaire en solutions de polymeres apparait de plus en plus comme l'alternative de choix aux separations en gel pour l'adn. Nous presentons une etude destinee a comprendre les facteurs responsables du developpement d'instabilites electrohydrodynamiques conduisant a l'agregation de l'adn, un probleme rencontre quand on chercher a separer des molecules de 20 kb et plus en electrophorese capillaire pulsee. Nous presentons egalement une nouvelle approche pour la collection d'adn par transfert direct sur une membrane en sortie de capillaire, ouvrant la possibilite d'utiliser l'electrophorese en mode micro-preparatif. La detection d'echantillons d'adn dans les gammes 150 bp-2 kbp et 120 kbp-23 kbp a ainsi ete effectuee par colorimetrie post-separation. Enfin, nous nous sommes interesses a l'autre limite de la gamme des tailles d'adn separables en capillaire, la resolution de petits fragments a la base pres. Nous avons utilise pour cela une nouvelle famille de milieux de separation, les polymeres associatifs. Nous avons demontre qu'une solution de polyoxyethylene de faible polydispersite, portant a ses extremites des blocs n-dodecane, constitue dans sa phase cubique un milieu de choix pour de telles separation.