Thèse soutenue

Analyse structurale des sites recepteurs muscariniques de l'acetylcholine par marquage de photoaffinite
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Auteur / Autrice : FRANCOIS AUTELITANO
Direction : Maurice Goeldner
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
Date : Soutenance en 1997
Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)

Résumé

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Comme pour la plupart des recepteurs couples aux proteines g, les informations structurales concernant les recepteurs muscariniques, et en particulier celles s'adressant a la definition du site de liaison des agonistes et/ou antagonistes, proviennent essentiellement de l'utilisation combinee de la mutagenese dirigee et de la modelisation moleculaire. L'interpretation des donnees ainsi obtenues n'est pas sans ambiguite et il est clair qu'a defaut de donnees cristallographiques decisives, la confrontation d'approches structurales differentes est necessaire. La modification chimique des sites recepteurs, par marquage d'affinite ou de photoaffinite peut contribuer efficacement a l'avancee des connaissances en ce domaine en permettant l'identification des acides amines directement impliques dans l'interaction ligand-recepteur. Cette approche biochimique est lourde et sa portee peut etre limitee par la reactivite preferentielle de la sonde utilisee : alkylation du seul et meme residu aspiii:08 par deux marqueurs d'affinite muscariniques presentant en commun l'ion aziridinium comme espece reactive. A cet egard, le marquage par photoaffinite des recepteurs muscariniques que nous avons entrepris a l'aide de deux sels d'aryldiazonium represente une alternative prometteuse puisque ces sondes manifestent, entre autres avantages, une grande reactivite chimiquement non discriminative. C'est ainsi qu'elles ont conduit a l'identification de nombreux residus differents appartenant au site de liaison de l'acetylcholine sur l'acetylcholinesterase et le recepteur nicotinique de l'acetylcholine. Dans le cadre de l'identification des residus impliques dans la liaison irreversible de ces ligands photosensibles aux recepteurs muscariniques, nous realisons des photomarquages preparatifs necessitant la purification de grandes quantites de recepteurs et la synthese des sondes tritiees a une haute activite specifique. Le marquage specifique covalent est caracterise et quantifie par analyse electrophoretique du materiel irradie : il resulte clairement d'un processus photochimique, manifeste une concentration-dependance nette, un rendement satisfaisant et s'adresse a une population proteique dont les proprietes de mobilite electrophoretique sont celles des proteines receptrices muscariniques. Ces deux ligands photoactivables trities sont donc des outils de choix pour explorer la poche receptrice des recepteurs muscariniques de l'acetylcholine apres purification des produits d'alkylation, sequencage des peptides radioactifs isoles et determination de la nature et de la position sur la sequence des residus alkyles.