Reconnaissance spécifique des cofacteurs NAD/NADP par les oxydoréductases : étude cristallographique du site de fixation du coenzyme dans la Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase de Bacillus stearothermophilus

par Claude Didierjean

Thèse de doctorat en Science des matériaux

Sous la direction de André Aubry.

Soutenue en 1997

à Nancy 1 , en partenariat avec Université Henri Poincaré Nancy 1. Faculté des sciences et techniques (autre partenaire) .


  • Résumé

    La glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) est une enzyme essentielle des voies métaboliques et appartient à la famille des oxydoréductases NAD(P) dépendantes. L'une de ses particularités est d'utiliser le NAD ou le NADP en fonction de sa localisation subcellulaire : la GAPDH glycolytique reconnait très spécifiquement le NAD, tandis que la GAPDH chloroplastique présente une dualité de cofacteur avec une préférence pour le NADP. L'objectif de ce travail cristallographique était de caractériser le mode de fixation du NADP dans des mutants de la GAPDH glycolytique de Bacillus stearothermophilus. Plusieurs résidus du site de fixation du NAD de l'enzyme glycotique ont été substitués pour inverser sa spécificité vers NADP : - les résidus 33 a 35, 187 et 188 ont été mutés par les résidus correspondants dans les séquences des GAPDH chloroplastiques - l'acide aspartique 32 a été muté pour éliminer les répulsions électrostatiques avec le phosphate supplémentaire du NADP situé en position 2' du ribose de l'adénosine. Les structures du triple mutant D32G-S (D32G, L187A, P188S) et du quintuple mutant B-S (L33T, T34G, D35G, L187A, P188S) complexés avec NAD+ et NADP+ ont été résolues. Les limites de résolution obtenues sont comprises entre 2. 5 et 2. 2 A. Les résultats structuraux apparaissent en parfait accord avec ceux obtenus en enzymologie et par RMN : - la reconnaissance efficace du NADP+ par le mutant D32G-S est en partie due à l'élimination de la répulsion électrostatique intra sous-unité (D32G) et à l'élimination des contraintes stérique inter sous-unité (L187A, P188S). De plus, le 2'-phosphate est stabilisé par la chaine latérale du résidu S188 nouvellement introduit. En comparant avec les sites de fixation du NADP naturels connus, ce résultat montre que la présence d'un résidu chargé positivement n'est pas absolument nécessaire pour inverser la sélectivité de cofacteur de NAD vers NADP. - dans le mutant B-S, la faible affinité de l'enzyme de type sauvage pour NADP+ semble subsister essentiellement en raison de la répulsion électrostatique entre le 2'-phosphate et le carboxylate du résidu D32. Ainsi, le mutant B-S ne mime pas efficacement les GAPDH chloroplastiques, et les effets à longue distance et/ou de second ordre, difficiles à mettre en évidence, doivent être pris en compte pour obtenir un mutant de la GAPDH cytosolique se comportant comme la DGPDH chloroplastique.

  • Titre traduit

    NAD/NADP discrimination in oxidoreductases : crystallographic study of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from bacillus stearothermophilus


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  • Détails : 1 vol. (IX-161 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 150-161

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