Selection de suppresseurs extrageniques d'une mutation faux-sens substituant le codon d'un residu essentiel dans le gene cpa1 chez saccharomyces cerevisiae

Selection of extragenic suppressor of a missense mutation which substitute the codon of an essential residue locating in the cpa1 gene of saccharomyces cerevisiae

• Auteur / Autrice : ANNE BERNARD
• Direction : R. JUND
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1996
• Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)

Résumé

Dans le but de mieux comprendre les interactions impliquees dans la reconnaissance de l'acide aspartique par l'aspartyl-tarn synthetase cytoplasmique de s. Cerevisiae, nous avons mis au point un systeme de selection in vivo de mutants de misacylation. Cette selection est basee sur la restauration de l'activite de la petite sous-unite de la carbamylphosphate synthetase de la voie de biosynthese de l'arginine, codee par le gene cpa1. Le codon cysteinyl (codant pour la cysteine 264, residu essentiel a l'activite glutaminase de la proteine) est remplace par un codon aspartyl, entrainant une auxotrophie pour l'arginine et l'uracile d'une souche cpa1 cpu, liee a une perte de l'activite de cpa1. La restauration de la fonction carbamylphosphate synthetase se traduit par un phenotype arg#+ura#+ des cellules et pourrait etre correlee a l'incorporation d'une cysteine codee par le codon aspartyl, suite a une mauvaise charge d'un tarn#a#s#p par un mutant de l'aspartyl-tarn synthetase. Cette selection nous a permis d'isoler 23 mutants suppresseurs caracterises par une croissance sur milieu minimum. Cependant, ces mutants ne sont pas des mutants de misacylation de l'aspartyl-tarn synthetase. Nous avons montre que le gene cpa2, codant pour la grande sous-unite de la carbamylphosphate synthetase, bien que necessaire a l'expression du phenotype mutant, n'est pas le gene suppresseur. Le systeme de selection nous a egalement permis d'etudier l'importance de certains residus pour l'activite de la proteine cpa1. Ainsi, nous avons pu montre que la proline 259, la phenylalanine 261, l'histidine 267 et la glutamine 268 ne sont pas necessaires a l'activite glutaminase. La cysteine 264, l'histidine 307 et l'histidine 349 sont importantes pour l'activite de la proteine: l'histidine 307 serait impliquee dans l'affinite de cpa1 pour la glutamine et les deux autres residus seraient impliques dans la catalyse. Grace a l'utilisation d'alleles non fonctionnels de cpa1 nous avons montre que la carbamylphosphate synthetase peut utiliser l'ammoniac comme substrat in vivo. Ces memes alleles utilisateurs d'ammonium sont aussi corriges par la mutation suppresseur. Ceci tend a ecarter l'hypothese de l'implication d'un element du controle de la traduction