Analyse biochimique et genetique de l'interaction entre le represseur lexa et l'adn

Biochemical and genetic analysis of the interaction between the lexa repressor and dna

• Auteur / Autrice : PASCAL DUMOULIN
• Direction : M. SCHNARR
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1995
• Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)

Résumé

Pour repondre a la question: comment l'helice trois se positionne-t-elle dans le grand sillon de l'adn, nous avons realise un photo-pontage specifique en modifiant un mutant du represseur lexa qui contient une cysteine unique en position cinquante deux, donc a l'extremite carboxy-terminale de l'helice trois. Les donnees de pontage impliquent que l'helice de reconnaissance de lexa est orientee dans le sens contraire generalement observe dans la famille des proteines a hth, et que cette helice doit former un angle plus fort par rapport au plan des paires de bases que dans le cas des proteines a hth standard. Dans un second temps, toute la structure du complexe du represseur lexa avec un fragment d'adn, portant l'operateur sos consensus, a ete sondee par clivage d'affinite et par photo-pontage d'affinite. Des residus cysteine uniques, introduits aux positions sept, vingt huit, trente huit et cinquante deux de la proteine, ont ete modifies chimiquement par soit, du p-azidophenacyl bromide ou par du s-(deux-pyridylthio)cysteaminyl-edta, pour sonder le complexe proteine-adn. A l'aide de la structure connue du domaine de liaison a l'adn et d'un fragment d'adn de forme b standard, nous avons construit un modele du complexe lexa-adn compatible avec ces donnees biochimiques. Le modele montre que l'helice de reconnaissance est dans le grand sillon et qu'elle forme un angle d'environ trente degre par rapport aux bases. Le motif hth de lexa est oriente de facon a ce que la partie amino-terminale de l'helice deux et de l'helice trois soient orientees vers l'axe de symetrie de l'operateur. En dehors de l'helice de reconnaissance, le modele montre que la partie amino-terminale de la premiere helice et de la seconde, ainsi que la boucle entre les deux feuillets beta sont aussi a proximite se l'adn. Finalement, les interactions possibles ont ete testees par des experiences d'interference par methylation, par ethylation ainsi qu'aux uraci les, et, les residus de l'helice trois impliques dans l'interaction specifique avec l'adn ont ete sondes par mutagenese dirigee