Contribution à l’étude moléculaire, physiologique et biochimique de pyrrolidone carboxyle peptidases bactériennes

= Contibution to the molecular physiologyand biochemical study of pyrrolidone carboxyl peptidases

• Auteur / Autrice : Thierry Gonzales
• Direction : Janine Robert-Baudouy
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance en 1996
• Etablissement(s) : Lyon, INSA
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé (Villeurbanne1995-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : LGMMIC - Laboratoire de Génétique Moléculaire des Microorganismes et des Interactions Cellulaires, UMR 5577 (Lyon, INSA1994-2000)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Pyrrolidones

Bactéries

Aminopeptidases

Résumé

Les pyrrolidone carboxyle peptidases (Peps) catalysent le clivage des résidus pyroglutamyles situés à l'extrémité N-terminale de certaines protéines. Le gène conférant l'activité Pep de Pseudomonas fluorescens a été caractérisé. Il code un polypeptide de 213 acides aminés (22 441 Da) qui présente de fortes similitudes de séquence avec les Pcps de Streptococcus pyogenes, Bacillus subtilis etBacillus amyloliquefaciens précédemment étudiées. Des vecteurs portant le gène pep de P. Fluorescens en tant que gene rapponeur ont été développés. La régulation de l'expression des activités Pcps de P. Jluorescens et B. Subtilisa été analysée. Aucune régulation n'a été mise en évidence pour la Pep de B. Subtilis. En revanche, l'expression de l'activité Pep chez P. Fluorescens est maximale en fin de phase exponentielle de croissance et induite en présence de résidus pyroglutamyles dans le milieu de culture. Ces résultats laissent supposer un rôle, pour cette enzyme, dans la dégradation des pyroglutamyle-peptides générés lors du renouvellement protéique intracellulaire. La purification des Pcps de P. Fluorescens, S. Pyogenes et B. Subtilis surproduites chezE. Coli a été réalisée. Ces ttois enzymes présentent des propriétés physico-chimiques et enzymatiques similaires. Des expériences de mutagenèse dirigée effectuées sur la Pep de P. Fluorescens ont permis d'identifier les résidus Cys-144 et His-166 de l'enzyme comme faisant partie du site catalytique. De plus, des études immunologiques effectuées à l'aides d'anticorps polyclonaux dirigés contre la Pep de S. Pyogènes ont mis en évidence l'existence probable d'épitopes communs entre les Pcps bactériennes et certaines Pcps de mammifères.

Pyrrodilone carboxyl pepetidases (Pcos) are aminopeptidases that remove amino terminal L-pyroglutamino acid form peptides and proteins. The gene encoding Pcp from pseudomonas fluorescens was characterized. It codes for a polypeptide of 213 amino acids (22441 Da) which has significant homology with the previously characterized Pcps from streptococcus pyogenes, Bacillus subtilis, and Bacillus amyloliquefaciens. Vectors with the P, fluorescenc pcp gene as reporter gene have been developed. Regulationol Pcp activity expression was analyzed in P. Fluorescens and B. Subtilis. No regulation was detected for enzyme production in B. Subtilis. In contrast, the expression of Pcp activity in P. Fluorescens was maximal at the culture media. These results suggest a function for this enzyme in the degradation of pyroglutamy peptide generated during inter cellular protein turn over. Purification of the various Pcps(P,fluorescens B. Subtilis and S. Pyogenes) over expressed in E. Coli was performed. Those three enzymes showed similar physicochemical and enzymatic properties. Directed mutagenesis experiments on the P. Fluorescens Pcp allowed identifying Cys-144 and His-166 residues as catalytic amino acids. In addition, immunological studies performed with polyclonal antibodies raised against S. Pyogenes enzyme have revealed a probable phylogenetic relationship between bacterial and some mammalian Pcps.