Réalisation d'électrodes enzymatiques à réponse rapide pour l'analyse par injection en flux continu (FIA). Application au suivi en ligne de la production de pénicilline par fermentation

par Helmut Meier

Thèse de doctorat en Génie des procédésGénie des procédés

Sous la direction de Canh Tran Minh.

Soutenue en 1993

à Grenoble INPG en cotutelle avec Saint-Etienne, EMSE , en partenariat avec École nationale supérieure des mines (Saint-Etienne) (autre partenaire) .


  • Résumé

    Ce travail concerne la réalisation d'une électrode enzymatique utilisable pour le suivi en ligne (on-line) d'un procédé de fermentation. Cette étude a nécessité la mise au point d'une nouvelle technique d'immobilisation, applicable à différentes enzymes. Elle est basée sur la formation de liaisons covalentes entre l'enzyme et l'agent portant: le glutaraldehyde. La méthode consiste en une adsorption de l'enzyme suivie du dépôt, par vaporisation, de l'agent réticulant sur l'extrémité sensible des électrodes de pH en verre. Ce procédé d'immobilisation assure un temps de réponse extrêmement court du biocapteur. Cette performance est un avantage indéniable pour des mesures en continu, tel qu'un système d'analyse par injection en flux continu (FIA). Par la suite, nous avons développé des systèmes FIA incorporant trois différents types de cellules de détection appropriées aux besoins analytiques. Des électrodes à pénicillinase et à uréase, préparées selon la méthode décrite ci-dessus, ont été installées et utilisées dans ces cellules. Les systèmes biocapteurs-FIA, ainsi conçus, ne nécessitent alors ni réacteur enzymatique, ni réactif. De plus, le temps de réponse très court du biocapteur allie aux avantages de la FIA et aux spécificités des cellules a permis d'obtenir une cadence de mesure très élevée. Ce système d'analyse a été applique aux mesures en ligne de la concentration de pénicilline au cours de sa production fermentaire et aux mesures automatiques de l'urée dans les échantillons de sérum humain. Pour cela, nous avons automatise le système biocapteur-FIAet conçu une nouvelle cellule a écoulement agite pour l'installation des électrodes a uréase et a pénicillinase. Ce système biocapteur-FIA donne des résultats satisfaisants pour la détermination de l'urée et surtout s'est révélé extrêmement performant pour le suivi hors ligne et en ligne de la concentration de pénicilline pendant plusieurs fermentations d'une durée de 250 heures environ. Dans ce dernier cas, la comparaison des mesures effectuées avec le système biocapteur-FIA et une méthode classique de dosage (HPLC) est favorable à l'analyseur biocapteur-FIA qui assure des mesures en ligne avec une bonne fiabilité et a un moindre cout, mais aussi en raison de sa simplicité. En rendant possible une exploitation immédiate des mesures en ligne de la concentration en pénicilline par l'ordinateur central de l'installation fermentaire, le système biocapteur-FIA présente un pas important dans l'amélioration du contrôle et/ou de la modélisation des bioprocédés.

  • Titre traduit

    Development of fast response enzyme electrodes for flow injection analysis (FIA). Application to continuous on-line measurement of penicillin production by fermentation


  • Résumé

    This work concerns the development of an enzyme electrode which can be used for continuous on-line measurement in a fermentation process. Firstly, it was necessary to develop a new enzyme immobilization technique which would be applicable to a number of different enzymes. This technique is based on covalent bonding between the enzyme and the linking agent: glutaraldehyde. The method consists first of enzyme adsorption and then of deposition by vaporisation of the linking agent onto the sensitive end of pH glass electrodes. This immobilisation technique ensures a very short response time of the biosensor. Such performance is an undeniable advantage for continuous measurement by methods such as FIA. We then designed several FM systems which incorporate three different detection cells, each configured to specific analytical needs. Pencillin and urea electrodes, prepared using the above technique, were installed and used in these cells. The biosensor-FIA systems thus developed require neither an enzyme reactor nor reactants. In addition to this, the very short response time of the biosensors together with the advantages of the FM system and the specific properties of the detection cells lead to a high sample throughput. This analysis system was applied to the on-line measurement of the penicillin concentration during its production by fermentation and to automatic measurements of the urea concentration in human serum samples. For this, we have automated the biosensor-FIA system and designed a new stirred-flow detection cell for the installation of the penicillin and urea electrodes. This biosensor-FIA system gives satisfactory results for the determination of urea and has proved especially performant in both off- and on-line monitoring of penicillin concentration during its production in several fermentations (each run-time was approximately 250 hrs). In a direct comparison with a classical analytical method (KPLC), the biosensor-FIA system was shown to be preferable due to a combination of its on-line measurement possibilities together with its reliability, simplicity and low cost. In making possible the immediate use of the penicillin concentration by the central computer in a fermentation installation, the biosensor-FIA system is an important step towards better control and modelisation of bioprocesses.


  • Résumé

    Die vorliegende Arbeit beschreibt die Herstellung einer Enzym-Elektrode, die für das on-line-Monitoring an Fermentationsprozessen eingesetzt werden kann. Es wurde eine neue Technik zur Enzym-Immobilisierung entwickelt, die für die Fixierung verschiedener Enzyme verwendbar ist. Sie basiert auf der Bildung von kovalenten Bindungen zwischen dem Enzym und dem bifunktionellen Reagenz Glutaraldehyd. Dabei wird zunächst das Enzym auf das selektive Ende einer pH- Elektrode adsorbiert und anschließend das bifunktionelle Reagenz zur intermolekularen Quervernetzung des Enzyms durch Zerstäuben auf den Enzymfilm aufgebracht. Die Enzym-Immobilisierungstechnik gewährleistet eine extrem kurze Antwortzeit des Biosensors. Diese Eigenschaft stellt einen bedeutenden Vorteil bei kontinuierlichen Messungen, wie z. B. Die Fließinjektionsanalyse (FIA), dar. In der Folge wurden FIA-S y steme mit drei unterschiedlichen Meßzellen entwickelt, die den analytischen Bedürfnissen angepasst sind. Penicillin- und Harnstoffelektroden, die nach der oben genannten Methode hergestellt wurden, sind in die Meßzellen installiert worden. Die so konzipierten Biosensor-FIA-Systeme benötigen weder einen Enzymreaktor, noch Reaktive. Außerdem läßt die sehr kurze Antwortzeit des Biosensors, die an die Vorteile des FIA-Systems und die spezifischen Eigenschaften der Meßzellen geknüpft ist, eine sehr hohe Analysenfrequenz zu. Das Analysesystem wurde zum on-line-Fermentations Monitoring der Penicillinkonzentration und zur automatischen Messung von Harnstoff in Proben des menschlichen Serums eingesetzt. Um diese Applikationen zu ermöglichen, wurde das Biosensor-FIA-System automatisiert. Die Penicillin- und Harnstoffelektroden sind in einer speziell für diese Anwendungen entwickelten Meßzelle installiert, in der die Verdünnung und Messung der Probe erfolgt. Die erhaltenen Ergebnisse bei der Bestimmung der Harnstoffkonzentration sind gut. Vor allem hat sich das Analysesystem beim off-line- und on-line-Monitoring der Penicillinkonzenuation während mehrerer Fermentationen über eine Dauer von Ca. 250 Stunden bewährt. Das Biosensor-FIA-System zeigt im Vergleich zur klassischen HPLC-Analysemethode mehrere Vorteile: Realisierung kontinuierlicher on-line-Messungen, hohe Zuverlässigkeit, geringe Kosten und einfacher Funktionsaufbau. Die durch die on-line-Analytik unmittelbar verfügbare Penicillinkonzentration bietet die Möglichkeit der on-line-Auswertung durch den Zentralcomputer in der Fermentationsversuchsanlage. Auf diese Weise kann das entwickelte Biosensor-FIA-System einen bedeutenden Schritt in der Verbesserung der Kontrolle und/oder Modellbildung von Bioprozessen leisten.

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  • Détails : 1 vol. (174 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 161-171

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  • Bibliothèque : Université Grenoble Alpes (Saint-Martin d'Hères, Isère). Bibliothèque et Appui à la Science Ouverte. Bibliothèque universitaire Joseph-Fourier.
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  • Bibliothèque : Université Grenoble Alpes (Saint-Martin d'Hères, Isère). Bibliothèque et Appui à la Science Ouverte. Bibliothèque universitaire Joseph-Fourier.
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  • Cote : TS 93/INPG/4205
  • Bibliothèque : Ecole nationale supérieure des mines. Centre de documentation et d'information.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : SPIN
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