Expression de deux isoenzymes d'alpha-amylase d'orge chez la levure saccharomyces cerevisiae : apport de la recombinaison homéologue à l'étude de la sécrétion et des relations structure-fonction

par Nathalie Juge

Thèse de doctorat en Biochimie. Nutrition, aspects moléculaires et cellulaires

Sous la direction de Jean-Claude Chaix.

Soutenue en 1993

à Aix-Marseille 3 .


  • Résumé

    Le travail de recherche presente dans ce memoire porte sur l'etude de deux isoenzymes de l'-amylase d'orge amy1 et amy2 par le biais de leur expression dans la levure saccharomyces cerevisiae. Les deux cdnas amy1 et amy2 sont inseres dans le vecteur d'expression episomal pma91 sous le controle du promoteur constitutif pgk et diriges par leur propre sequence signal. Dans ces conditions, l'isoenzyme recombinant reamy1 est secrete a raison de 2-3 g/ml alors que reamy2 n'est pratiquement pas detecte dans le milieu exterieur. L'analyse moleculaire de l'expression de ces deux isoenzymes a permis de circonscrire l'etape limitante de reamy2 au processus de secretion. La recherche des determinants structuraux responsables de cette difference de secretion a ete entreprise avec pour corollaire l'amelioration de la secretion de reamy2 ou d'une proteine presentant les proprietes d'amy2. L'axe central de cette etude repose sur la construction de molecules hybrides reamy1/reamy2 par recombinaison homologue in vivo chez la levure. Deux types de constructions ont ete realises afin de substituer des regions d'amy2 par les regions correspondantes d'amy1, la premiere consistant a echanger des longueurs croissantes en n-terminal de la molecule et la deuxieme visant a echanger la region c-terminale dans sa totalite. L'analyse moleculaire des differents hybrides obtenus revele une augmentation de la secretion pour les hybrides contenant au moins les 53 premiers residus d'amy1 en n-terminal de la molecule. Inversement, le seul changement de la sequence signal ou de la region c-terminale n'influence pas la secretion. La possibilite de faire secreter ces proteines hybrides a permis d'envisager leur caracterisation biochimique. Dans ce but, une nouvelle construction a ete realisee en vue d'etendre la region n-terminale d'amy1 a la fin du domaine b de la proteine reamy1/reamy2. Trois hybrides ont ete retenus sur la base de leur structure chimerique et analyses. Les resultats biochimiques soulignent l'importance du domaine b dans la liaison a l'inhibiteur basi, l'activite de l'enzyme et la stabilite a ph acide

  • Titre traduit

    Expression of two barley alpha-amylases isozymes in the yeast saccharomyces cerevisiae: investigations of secretion mechanisms and structure-function relationships using in vivo recombination


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  • Détails : 168, [3] f.

Où se trouve cette thèse\u00a0?

  • Bibliothèque : Université d'Aix-Marseille (Marseille. Saint-Jérôme). Service commun de la documentation. Bibliothèque de sciences - Inspé.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : T 2050/A-B
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