Influence de l’environnement sur la modulation de l’activité endonucléasique des enzymes de restriction et sur la stabilité des plasmides recombinés

Influence of the environment on the specificity of restriction endonucleases and on the stability of recombinant plasmids

• Auteur / Autrice : Moncef Nasri
• Direction : Daniel Thomas
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génie enzymatique, bioconversion et microbiologie
• Date : Soutenance en 1987
• Etablissement(s) : Compiègne
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale 71, Sciences pour l'ingénieur (Compiègne)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Escherichia coli

Clonage moléculaire

Spécificité (immunologie)

Plasmides

Relaxation, Phénomènes de

Enzymes immobilisées

Enzymes de restriction

Endonucléases

Mots clés libres

Stabilité

Résumé

Dans ce travail, trois approches principales ont été développées : l’étude du mécanisme de relaxation des enzymes de restriction, l’influence de l’immobilisation sur la stabilité de ces endonucléases et sur la stabilité des micro-organismes manipulées génétiquement. La spécificité des endonucléases de restriction PvuII, HindIII et Sacl peut-être réduite en présence de solvants organiques. Dans ces conditions, les enzymes reconnaissent des sites, qui différent, à chaque fois, du site standard, au niveau d’une seule position. Ce phénomène de relaxation est attribué aux pertes de liaisons hydrogène entre les endonucléases et chaque paire de base reconnue par les enzymes, diminuant ainsi, la spécificité des enzymes et les vitesses de coupure des sites additionnels. Dans une deuxième partie, nous avons montré que les enzymes PvuII et HindIII immobilisées sur p-ABcellulose par l’intermédiaire de leurs groupements phénoliques retiennent des activités partielles et sont stables pendant plus de deux mois. Dans une troisième partie, nous avons montré que par opposition au système libre, dans un système immobilisé le plasmide pTG201, portant le gène xyIE (qui code pour l’activité catéchol 2,3-dioxygénase) est maintenu très stable dans les différentes souches d’Escherichia coli utilisées. La stabilité du pTG201 est probablement due aux conditions nouvelles de prolifération cellulaire, avant que ceux-ci sortent du gel. Finalement, un système à deux réacteurs permettant de surmonter l’impact de la forte expression du gène cloné sur la stabilité du pTG201 est développé.

In the study, three main approaches were developed : relaxation mechanism of restriction endonucleases, influence of the immobilization on the stability of these endonucleases and on the stability of recombinant micro-organisms. The specificity of PvuII, HindIII and Sacl restriction endonucleases is relaxed in the presence of organic solvents. In these altered reaction media, the enzymes recognize and cleave DNA at additional sites that differ from the standard one by one nucleotide. The relaxation in specificity is related to the loss of hydrogen bonds between the enzyme and each base pair to recognized, lowering both specificity of the endonucleases and the hydrolysis rate of relaxed sites. In the second part, we have shown that immobilized of PvuII and HindIII endonucleases retained partial enzyme activities, when immobilized through phenolic groups, and were stable for at least two months. In the third part, we have shown that pTG201 plasmid (containing xyIE, the gene encoding for catechol 2,3-dioxygenase) which free E. Coli, is maintained extremely stable in continuous cultures with immobilized cells. The mechanism of plasmid stability in the carrageenan beads is explored. This appears to be due to the mechanical properties of the gel-bead system that only allow a limited number of cell divisions to occur in each clone of cell before the clone escape from the gel bead. Finally, a two-stage continuous culture system is developed to overcome the impact of the high level expression of xyIE on the stability of pTG201.