La transformation par Agrobacterium rhizogenes : étude des plasmides de deux souches à agropine et de la structure de l'ADN-t dans des plantes transformées

• Auteur / Autrice : Lise Jouanin
• Direction : Francine Casse
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques
• Date : Soutenance en 1986
• Etablissement(s) : Paris 11
• Partenaire(s) de recherche : autre partenaire : Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne)
• Jury : Président / Présidente : Jacques-Henry Weil
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Léon Otten, Marc Van Montagu, Jean-Claude Mounolou, Francis Quétier, Francine Casse, Jacques-Henry Weil
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Léon Otten

Mots clés

Mots clés contrôlés

Clonage moléculaire

Plasmides

Agrobacterium rhizogenes

Mots clés libres

Transformation génétique des plantes

Origine de réplication

Cartes de restriction

ADN de transfert

Résumé

Agrobacterium rhizogenes, par l'intermédiaire de son plasmide Ri (pour root-inducing) est responsable du syndrome du "hairy root" sur certaines plantes. La souche HRI possède un seul plasmide (pRiHRI) tandis que la souche A4 en possède trois (pArA4a, pRiA4 et pArA4c). Les plasmides de ces deux souches à agropine ont été clonés dans un cosmide. PRiHRI (254 kb) et pRiA4 (250 kb) sont les plasmides responsables de la transformation génétique des cellules végétales. Leurs cartes de restriction sont très semblables, en particulier dans les régions dont les fonctions sont connues: région transférée (T), région de virulence et origine de réplication. PArA4a (180 kb)et pRi A4 possèdent une région commune qui permet d'expliquer la possibilité de recombinaison de ces deux plasmides pour former le coïntégrat pArA4c (430 kb)Les origines de réplication de pArA4a'et pKiA4 (ou pRiHRI)ne présentent pas d'homologie de séquence et sont compatibles avec tous les plasmides d'Agrobacterium tumefaciens Les régions impliquées dans la réplication ont été cartographiées et des cosmides navettes (10,9 kb et 8,1 kb)ont été construits chez E. Coli ; ces vecteurs sont maintenus dans Agrobacterium de manière très stable, même en absence de sélection. L'organisation de l'ADN transféré lors de la transformation a été analysée dans quelques plantes transformées (Convolvulus arvensis, Nicotiana plumbaginifolia, Nicotiana tabacum et Brassica napus); l'ADN-T se compose de deux parties: TL et TR, non contigues sur le plasmide Ri. L'ADN-TL a une taille d'environ 20 kb, avec des frontières paraissant fixes pour toutes les plantes étudiées à l'exception du tabac où il est toujours plus court. L'ADN-TR a une taille beaucoup plus variable de 0 à environ 30 kb. Il contient les gènes de synthèse de la mannopine et de l'agropine et une région pas toujours intégrée, homologue aux gènes de l'ADN-T de pTi, responsables de la synthèse d'auxine, dans les cellules transformées. Le nombre de copies de l'ADN-Test variable de 1 à 4 et certaines copies d'ADN-TL et TR peuvent être adjacentes dans le génome de la plante, avec inversion de la région TR par rapport à son orientation vis-à-vis de la région TL sur le plasmide. Une banque dans le phage Charon 4A de l'ADN d'un clone transformé de C. Arvensis (clone 7) a été réalisée, et des phages recombinants contenant différentes parties de l'ADN-T de la plante ont été sélectionnés. La comparaison des séquences des régions frontières dans ces clones avec la séquence déjà déterminée de la région TL dans pRiA4, a permis de montrer que la partie TL intégrée dans le génome végétal est bordée dans le plasmide par deux séquences très homologues à celles observées aux frontières de la région-T chez A. Tumefaciens. Les possibilités d'utilisation du plasmide Ri comme pour la transformation des plantes supérieures sont vecteur de génie génétique discutées en conclusion.

Agrobacterium rhizogenes has the ability to induce hairy root, by inserting part of its root-inducing plasmid (pRi) in the plant genome. Plasmids of agropine-type A. Rhizogenes strains HKI (one plasmid, pRiHRI) and A4 (three plasmids, pArA4a, pRiA4 and pArA4c) were cloned in the cosmid PHDG262 and the libraries obtained were used to establish the restriction maps of the plasmids. The pRiHRI (254 Kb)and pRiA4 (250 kb)maps are very quiet similar and are identical in the regions where functions have been localized: T-region, virulence region and origin of replication. PArA4a (1 0 kb) and pRiA4 nave one identical region which can explain their ability to cointegrate to form pArA4c (430 kb). The origins of replication of pRiHRI and pArA4a were localized precisely, they are not homologous and are compatible with A. Tumefaciens plasmids. Cosmids containing them were used to construct vectors able to replicate in both E. Coli and Agrobacterium. These vectors are maintained stably in Agrobacterium even without selection pressure. The T-UNA structure was studied in regenerated transformed plants (Nicotiana plumbaginifolia, Nicotiana tabacum, Brassica napus and Convolvulus arvensis). The T-DNA consists of two parts: TL and TR which are not contiguous on the Ri plasmid. In all plants studied, except N. Tabacum where it is smaller, the size of the TL-DNA is constant (19-20 kb), while the size of the TR-DNA is variable (0 to 30 kb). The TR region includes the agropine synthesis genes and a region homologous to the tms genes in pTi; this last region is not always transferred to the plant genome. The copy number varies from one to four copies and some TL and TR copies are linked in the plant genome. A library of a transformed C. Arvensis plant was constructed in Charon 4A and recombinant phages including parts of the T-DNA were selected. The nucleotide sequences of the frontier regions of the TL-DNA were determined in both the plasmid and in the phages. Two direct repeats of 25 bp, highly homologous to those observed in Ti plasmids were found in pRi, at or near the TL-DNA borders. The TR-DNA is inverted in the plant genome, as compared to its orientation relative to the TL-DNA position in the Ri plasmid. The use of the Ri plasmid as a vector for genetic engireering of higher plants is discussed in conclusion.